响应曲面法优化厚朴酚-β-环糊精包合物的制备工艺

岳金金，张喜月，刘金颖，刘慧婷，张 玲

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001）

厚朴酚是从中药厚朴中提取的一种含有酚羟基的生物活性物质，具有扩张血管、抗炎、抗菌、抑制血小板聚集和抗心律失常等多种作用，在医药等领域中有广泛的应用。但厚朴酚性状不稳定，在水中的溶解度和分散性差，不易加工、贮藏，使其应用受到一定的限制（沈映君，1997）。β-环糊精（β-CD）具有空腔内径大小适中、包合力强、经济易得等优点，与难溶性药物容易形成稳定的水合物，制成的包合物具有性质稳定、不易挥发、有较高的水溶性和良好的分散性等特点，不仅能增加药物分子的溶解度，还能提高药物的稳定性和生物利用度（安伟娟等，2008）。

本试验采用研磨法制备厚朴酚-β-环糊精包合物（厚朴酚-β-CD），运用响应曲面法优化其制备工艺条件，为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器 DZKW-4电子恒温水浴锅 （北京中兴伟业仪器有限公司）、FA1004N电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）、SHZ-ⅢB型循环水真空泵 （浙江临海市精工真空设备厂）、DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海一恒科学仪器有限公司）、紫外分光光度计（南京强拓科技有限公司）。

1.1.2 试剂 厚朴酚 （西安开来生物工程有限公司，批号：538438）；β-环糊精（中国上海惠世生化试剂有限公司，批号：120108）；甲醇、异丙醇、无水乙醇和石油醚均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 厚朴酚包合物的制备 参照桂卉等（2005）的方法，精密称取β-环糊精，加入4倍量的水搅拌溶解，制备出β-环糊精的饱和水溶液。将饱和水溶液倒入研钵中，并将研钵置于60℃恒温水浴锅中，研磨1 h后，待β-环糊精呈现糊状后，缓慢滴加用有机溶剂溶解的厚朴酚，继续研磨，直至再次呈现糊状后使用真空泵抽滤，并用石油醚洗涤三次，干燥后备用。

1.2.2 厚朴酚-β-环糊精包合物中厚朴酚含量的测定

1.2.2.1 对照品溶液的制备 取60℃减压干燥4 h的厚朴酚对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，加无水甲醇（色谱纯）溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

1.2.2.2 标准曲线的制备 精密称取适量厚朴酚，用无水乙醇稀释成浓度为 3、5、7、9、11、13、15 μg/mL的系列标准溶液，于298 nm处测定吸光度，确定浓度（C）与吸光度（A）之间的线性关系。

1.2.2.3 含量测定 称取厚朴酚-β-环糊精包合物1 mg，用50%乙醇溶解，定容至10 mL；再吸取1.0 mL置于10 mL容量瓶中用50%乙醇溶液稀释并定容。在298 nm处测定样品的吸光度，根据回归方程求得厚朴酚的浓度，从而求出包合物中厚朴酚的含量。

1.2.3 单因素试验 以β-环糊精与厚朴酚的比例（A）、研磨时间（B）、研磨温度（C）3 个因素进行单因素试验，按照1.2.1所述方法包合厚朴酚，并计算出被包合的厚朴酚的量。

1.2.3.1 β-环糊精与厚朴酚的比例对厚朴酚含量的影响 在研磨时间30 min、研磨温度60℃的条件下，研究β-环糊精与厚朴酚的比例分别为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1 时对厚朴酚含量影响。

1.2.3.2 研磨时间对厚朴酚含量的影响 在β-环糊精与厚朴酚的比例为5∶1、研磨温度60℃的条件下，研究研磨时间分别为 10、20、30、40、50 min时对厚朴酚含量的影响。

1.2.3.3 研磨温度对厚朴酚含量的影响 在β-环糊精与厚朴酚的比例为5∶1、研磨时间30 min的条件下，研究包合温度分别为 45、50、55、60、65 ℃时对厚朴酚含量的影响。

1.2.3.4 响应曲面设计 在单因素试验结果的最优水平基础上，根据Box-Behnken设计原理，以厚朴酚含量（Y）为响应值，利用Design Expert 7.0软件设计三因素三水平的响应曲面试验，选取β-环糊精与厚朴酚的比例（A）、研磨时间（B）、研磨温度（C）三个影响因素，因素及水平见表1。

表1 响应面优化试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 β-环糊精与厚朴酚的比例对厚朴酚含量的影响 由图1可见，随β-环糊精与厚朴酚比例的增加，包合物中厚朴酚的含量开始增高，当比例达到5∶1时厚朴酚含量最高，之后开始下降。从厚朴酚含量考虑，将二者比例控制在5∶1左右为宜。

图1 β-环糊精与厚朴酚的比例对厚朴酚含量影响

2.1.2 研磨时间对厚朴酚含量的影响 由图2可见，随着研磨时间的延长，包合物中厚朴酚含量开始增大，当时间为30 min时，厚朴酚含量达到一定高度。之后随着研磨时间的继续延长，厚朴酚含量不再有明显增加。结合实际情况考虑将研磨时间控制在30 min左右为宜。

图2 研磨时间对厚朴酚含量影响

2.1.3 研磨温度对厚朴酚含量的影响 由图3可见，随着研磨温度的增加，厚朴酚含量增大，当研磨温度达到60℃时，厚朴酚含量最高，随后又有所下降。综合考虑经济因素和后续工艺的简化，研磨温度以60℃左右为宜。

2.2 响应曲面优化试验 响应曲面优化试验的取值见表2，共15个试验点。前面12个是析因点，自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点；后面3个为零点，为区域的中心点，用以估计试验误差（任涛和钟洁，2011）。每次制得的包合物中厚朴酚含量见表2。

图3 研磨温度对厚朴酚含量影响

表2 厚朴酚-β-环糊精包合物制备工艺优化方案及结果

2.2.1 回归方程 用响应曲面法对β-环糊精与厚朴酚的比例（A）、研磨时间（B）、研磨温度（C）进行三因素三水平的分析，确定制备包合物的最佳条件，结果见表2。利用软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到模型的二次多项回归方程为：Y=20.50-0.34A+0.15B+0.038C-0.22AB-0.40AC-0.33BC-1.85A2-0.77B2-0.30C2。

2.2.2 回归模型方差分析 由表3结果可知，方程一次项A、二次项A2、B2和交互项中AC对厚朴酚含量的影响均达极显著水平（P＜0.01），二次项C2和交互BC对厚朴酚含量的影响显著 （P＜0.05），其余项均不显著。

2.2.3 响应曲面分析 利用Design Expert 7.0软件对表3的数据进行二次多元回归拟合，建立响应曲面，结果如图4所示。

图4a反映地是研磨温度为60℃时，β-环糊精与厚朴酚的比例和研磨时间对厚朴酚-β-环糊精包合物中厚朴酚含量的影响。当β-环糊精与厚朴酚的比例较低时，厚朴酚含量随着研磨时间的增加先增加后减小，当比例接近5∶1、时间接近30 min时，厚朴酚含量达到最大值。

表3 回归模型方差分析

图4b反映地是研磨时间为30 min，β-CD与厚朴酚的比例和研磨温度对包合物中厚朴酚含量的影响。包合物中厚朴酚含量随β-CD与厚朴酚的比例的增加而快速增加，当比例在5∶1附近、研磨温度大于60℃时可以达到响应值最高点。

图4c反映地是β-CD与厚朴酚的比例为5∶1时，研磨温度和研磨时间对厚朴酚含量的影响。结合图中曲线走势可见，曲线相对较陡，两因素的交互作用对厚朴酚含量的影响显著（P＜0.05）。

2.2.4 确定最优条件及验证试验 通过软件分析得到厚朴酚-β-CD的最优条件为：研磨温度60.81℃、研磨时间30.96 min、β-环糊精与厚朴酚的比例为4.89∶1，此时模型预测厚朴酚含量为20.59%。考虑实际操作，将试验条件修改为包合温度61℃、包合时间31 min、β-环糊精与厚朴酚的比例为4.9∶1。在此修正条件下进行了3次平行验证试验，厚朴酚-β-CD包合率的平均值为20.27%，RSD为0.47%，与理论预测值（20.59%）相比误差为0.32%。

3 讨论与结论

由回归模型方差分析结果可知：模型P＜0.01，说明本次试验的响应回归模型具有极显著水平；模型的校正系数R2＞0.99，说明该模型与实际试验拟合性非常好；R2Adj的数值表示该模型能解释97.36%响应值的变化，试验误差小，可以很好地描述β-CD与厚朴酚的比例、研磨时间、研磨温度与厚朴酚-β-CD包合率的真实关系。方程一次项、二次项和交互项的P值表明各个因素与响应值之间不是简单的线性关系，而具有一定的交互作用，采用响应曲面法进行的优化试验所得回归方程模型可以用来分析预测厚朴酚-β-CD的包合结果。得出最佳工艺条件为：研磨温度61℃、研磨时间31 min、β-环糊精与厚朴酚比例为 4.9∶1。通过在最佳条件下的验证试验表明，厚朴酚-β-CD包合物中厚朴酚含量为20.27%。可见运用响应曲面法优化厚朴酚-β-CD的制备工艺可以获得最大的厚朴酚含量，参数准确可靠，具有实用价值。

[1]安伟娟，锁然，李娜，等.白藜芦醇-羟丙基-β-环糊精包合物的制备及鉴定[J].河北农业大学学报，2008，32（1）：104.

[2]桂卉，刘东文，颜红，等.白术、木香混合挥发油β-CD包合物的制备与鉴定[J].中成药，2009，31（6）：864.

[3]任涛，钟洁.响应曲面法优化超声波辅助提取蒲公英糖蛋白工艺[J].食品工业科技，2011，32（7）：297～302.

[4]沈映君.中药药理学[M].上海：上海科学技术出版社，1997.83.