100%氧通过NO介导改善CLP诱导的小鼠脓毒症的杀菌机制

张二飞，罗志锴，李 莹，侯立朝，胡 彬(延安大学附属医院麻醉科，延安 76000;第四军医大学西京医院麻醉科;通讯作者，E-mail:ydfymzk@6.com)

脓毒症，是感染引起的全身炎性反应综合征，是住院患者最常见的死亡原因之一，死亡率高达20%-30%［1］。在美国住院患者中脓毒症的患病率是2%，这些病人中有近50%的患者需要在ICU中接收治疗［1］。在中国，脓毒症病人在ICU的死亡率也高达28.7%［2］，脓毒症的高死亡率、高花费越来越受到人们的重视。有研究表明100%氧对鼠的无菌性腹膜炎［3］和猪的有菌性腹膜炎［4］均有治疗作用，而且在ICU接受治疗的患者吸入100%氧也常常被用作支持治疗。人们普遍认为，当机体不能限制局部性的感染而使其发展为全身性感染，就激活全身性的炎性反应，进一步造成组织损伤［5］。所以脓毒症中机体清除细菌的能力对其预后非常重要。近来研究表明NO(nitric oxide)是个有效的杀菌分子［6，7］。盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)诱导的脓毒症模型被认为是经典的、模拟临床特征的动物模型［8，9］。因此本实验探索100%氧对盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症的改善作用及是否通过NO介导的细菌清除机制，以期为临床治疗脓毒症提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

动物:遵循第四军医大学实验动物管理和使用委员会批准的所有的动物协议。雄性C57BL/6小鼠(20-25 g)由第四军医大学实验动物中心获得。实验操作1周前，领取动物适应实验室的环境，保持室温(20-25℃)，用12 h光照-黑暗周期，并自由获取食物和水。一氧化氮检测试剂盒，一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)(NG-nitro L-arginine methylester)均为碧云天生物技术研究所(江苏省，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组和模型制作 按照完全随机的方法将C57BL/6小鼠分为4组:假手术+空气组，假手术+100%氧组，盲肠结扎穿孔术+空气组，盲肠结扎穿孔术 +100%氧组。雄性 C57BL/6小鼠(20-25 g)水合氯醛麻醉后，盲肠结扎穿孔术模型(脓毒症模型)具体制备步骤:小鼠下腹部备皮和消毒，纵向中线皮肤切口(约2 cm)，暴露盲肠，在远极和盲肠的基部之间50%的距离无菌线结扎盲肠，结扎处远端用21号针头穿刺盲肠，穿刺孔处挤出少量的粪便物质，然后原位放回盲肠，造成较重的脓毒症模型，存活率大约在30%左右。假手术模型制备:同样备皮、消毒、打开腹腔，然后，间断缝合腹壁两层，关闭腹腔。术毕，将小鼠放置于暖箱复苏，苏醒后放回恒温的动物房自由饮水进食。

1.2.2 100%氧治疗和生存率观察 治疗组:假手术+100%氧组和盲肠结扎穿孔术+100%氧组在假手术或盲肠结扎穿孔术后6 h，小鼠被放置在密封的有机玻璃室中。氧气通过一个软管输送到玻璃室中。密室的另一端连接气体分析仪(多功能气体分析仪，丹麦)连续监测，随时调节氧气流量使得治疗过程中氧浓度达95%-100%的预定水平，CO2由放置在密室中的吸收剂吸收，100%氧持续干预2 h，房间和密室的温度保持在20-22℃。对照组:假手术+空气组和盲肠结扎穿孔术+空气组，动物术中或苏醒后自由呼吸空气。所有的动物苏醒后，于鼠笼中放置于恒温的动物室，进行7 d的生存率观察(每组n=20)。

1.2.3 细菌计数 术后24 h，小鼠麻醉后，消毒下腹部，在原切口旁切开腹腔，注射无菌的生理盐水1 ml，轻轻摇晃腹腔1 min后，取腹腔液4 μl在冰上用无菌生理盐水连续稀释，然后于琼脂培养基中37℃温箱孵育，24 h后进行菌落数计数(每组n=6)。

1.2.4 NO检测 小鼠腹膜腔用2 ml的无菌生理盐水灌洗，小心地吸出，大约1 ml可获得，然后以400×g，5 min离心，分装，测定。NO的检测根据试剂盒的说明进行操作(每组n=6)。

1.2.5 NO合酶抑制剂的处理 按照完全随机的方法将C57BL/6小鼠分为5组:假手术+生理盐水+空气组，盲肠结扎穿孔术+生理盐水+空气组，盲肠结扎穿孔+L-NAME+空气组和盲肠结扎穿孔术+生理盐水+100%氧组，盲肠结扎穿孔术 +LNAME+100%氧组。治疗组:盲肠结扎穿孔术+LNAME+100%氧组，盲肠结扎穿孔+L-NAME+空气组，在手术后2 h给予腹腔注射L-NAME(20 mg/kg);对照组:假手术+生理盐水+空气组，盲肠结扎穿孔术+生理盐水+100%氧组和盲肠结扎穿孔术+生理盐水+空气组，在手术后2 h给予等体积的无菌生理盐水(每组n=6)。

2 结果

2.1 100%氧对脓毒症鼠的生存率影响

与假手术后吸入空气比较，盲肠结扎穿孔术后吸入空气明显导致小鼠死亡(P＜0.001，图1);与盲肠结扎穿孔术后吸入空气组比较，盲肠结扎穿孔后6 h吸入100%氧2 h明显提高了脓毒症鼠的生存率(P＜0.05);假手术后吸入100%氧无死亡与假手术+空气组生存率相同(见图1)。

图1 100%氧对脓毒症鼠的生存率影响(n=20)Figure 1 Effect of 100%oxygen on survival rate of septic mice(n=20)

2.2 100%氧对脓毒症鼠的细菌清除的影响

与假手术后吸入空气组比较，盲肠结扎穿孔术后吸入空气组腹腔灌洗液中明显培养出大量细菌(P＜0.001，见图2);与盲肠结扎穿孔术后吸入空气组比较，盲肠结扎穿孔术后6 h吸入100%氧2 h明显增强了脓毒症鼠的细菌清除(P＜0.001，见图2);假手术后吸入100%氧组腹腔灌洗液中同假手术后吸入空气组一样没有培养出细菌。

2.3 100%氧对脓毒症鼠腹腔灌洗液中NO含量的影响

与假手术后吸入空气组比较，盲肠结扎穿孔术后吸入空气组明显增加了腹腔灌洗液中NO的含量(P＜0.01，见图3);与盲肠结扎穿孔术后吸入空气组比较，盲肠结扎穿孔术后6 h吸入100%氧2 h进一步增加了脓毒症鼠腹腔灌洗液中NO的含量(P＜0.01，见图3);假手术后吸入100%氧组腹腔灌洗液中NO的含量同假手术后吸入空气组比较无统计学差异。

2.4 L-NAME对100%氧增强脓毒症鼠的细菌清除力的影响

与盲肠结扎穿孔术+生理盐水+空气组比较，盲肠结扎穿孔术+生理盐水+100%氧组腹腔灌洗液细菌培养计数明显减少(P＜0.001，见图4);与盲肠结扎穿孔术+生理盐水+100%氧组比较，盲肠结扎穿孔术+L-NAME+100%氧组腹腔灌洗液细菌培养计数明显增加(P＜0.01，见图4);盲肠+生理盐水+空气组腹腔灌洗液细菌培养计数无统计学差异。

图2 100%氧对脓毒症鼠的细菌清除的影响(n=6)Figure 2 Effect of 100%oxygen on bacterial clearance of septic mice(n=6)

图3 NO在腹腔灌洗液中的产量(n=6)Figure 3 NO production in peritoneal lavage fluids of sepsis mice(n=6)

图4 L-NAME对100%氧增强脓毒症鼠的细菌清除力的影响(n=6)Figure 4 The influence of L-NAME on 100%oxygen for bacterial clearance in septic mice(n=6)

3 讨论

脓毒症是一个综合征，不是一个疾病［10］，是微生物感染引发的一系列临床综合征，若机体不能限制感染于局部，就会引发全身的炎性反应，进一步促使组织器官损伤［5］。许多研究都在致力于寻找改善脓毒症的临床策略，但临床结果却并不理想［11］。100%氧在临床中是我们经常使用的，有研究表明100%氧对无菌性和有菌性腹膜炎的动物是有益的［3，4］，而且也有研究表明高压氧对失血性休克复苏后的6 h生存率有益［12］。严重的脓毒症常常表现为脓毒性休克［1，13］，需要接受 ICU 的治疗，在 ICU中目前吸入纯氧是最为常见的支持治疗之一，但是长期的氧吸入又带来氧中毒的并发症［14］。但合理的吸入策略是有益的，本小组的前期研究表明两次持续吸入100%氧2-3 h对酵母多糖诱导的腹膜炎有改善作用［3］，而且本实验在经典的脓毒症模型CLP(盲肠结扎穿孔)［8］中，手术后 6 h持续吸入100%氧2 h，脓毒症小鼠的生存率从30%提高到70%，同样我们并未发现假手术组术后6 h吸入100%氧2 h对小鼠有致死性或危害。

细菌的入侵是脓毒症的重要病理生理，机体对病原微生物的清除和防御是疾病发展转归的重要因素［5］。本实验发现100%氧吸入明显增强了脓毒症小鼠的细菌清除能力，这表明100%氧改善脓毒症小鼠的生存率是与提高机体细菌清除能力有关系的。目前研究表明NO是种有效的杀菌分子［6，7］，增加NO的产量明显改善了小鼠的脓毒症及脓毒症诱导的肺损伤［7，15］，也有研究表明补充 NO 的前体精氨酸可以改善脓毒症鼠的致死率［16］。本研究发现100%氧可以增加CLP诱导的脓毒症鼠术后24 h腹腔灌洗液中NO的含量。NO在细胞中通过NO合成酶以L-精氨酸和分子氧作为底物反应生成的［17］。为了进一步验证100%氧增加脓毒症鼠NO的含量与细菌清除有关，根据文献报道［6］，我们在术后2 h腹腔注射NO合酶抑制剂(L-NAME)，阻断NO的产生，24 h后取腹腔灌洗液细菌培养计数，结果表明:L-NAME显著逆转了100%氧增强细菌清除的能力。这些结果表明100%氧在CLP诱导的脓毒症后6 h吸入2 h可以明显提高脓毒症鼠的生存率，该保护效应是通过100%氧增加脓毒症鼠腹腔中NO产量介导的细菌清除。也有研究表明脓毒症中大量NO的产生增加了组织的损伤和心脏功能的抑制，但这备受争议［18］。也许适当的NO产生对脓毒症是有益的，具体的机制不清楚，还有待于后期的进一步研究。

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