法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库的构建和初步鉴定

刘 昀，孙秀珍，徐 晶，吴媛媛，史红阳，方 萍(西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科，西安 710004)

变态反应疾病如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤病等是严重危害人类健康的一大类疾病。应用基因重组技术制备重组变应原疫苗应用于变态反应疾病的诊断和治疗，不仅能提高诊断的特异性和敏感性，而且还能显著降低粗制变应原疫苗用于特异性免疫治疗(SIT)的副作用，成为国内外变态反应领域研究的主要方向。法国梧桐是城市主要绿化树木，主要种植在美国西南部、南美、非洲、亚洲南部、澳大利亚和新西兰［1］，在我国大多数城市可见到。国内外许多研究提示法国梧桐花粉是变态反应病重要的吸入性致敏原［2-5］。我们既往研究也发现法国梧桐花粉是西安地区主要的气传吸入致敏原［6］。本课题主要目的是构建法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库，为筛选法国梧桐花粉主要变应原阳性克隆及基因重组变应原疫苗的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

法国梧桐花粉的采集:于2012年3-4月份法国梧桐花粉季节，在西安市区采集法国梧桐花粉，9号分样筛过滤后立即装入瓶中，投入液氮罐内，-180℃冷冻保存。

1.2 试剂

TRIZOL Reagent购自 Invitrogen公司(美国)，Oligotex mRNA Spin-Column Kit购自QIAGEN公司(德国)，Uni-ZAP XR 载体、XL1-Blue MRF’、ZAP-cDNA Synthesis Kit及 ZAP-cDNA GigapackⅢ Gold Cloning Kit购自Stratagene公司(美国)，异丙醇、氯仿、乙醇、酚，12 mg/ml四环素、MgSO4、20% 麦芽糖均为分析纯，由我校采供中心提供。

1.3 方法

1.3.1 总RNA抽提及质检 法国梧桐花粉超声粉碎破壳，液氮研磨成组织匀浆，分别加入氯仿、异丙醇、乙醇及适量无RNA酶的水，充分溶解沉淀，经分光光度计测定A260nm和A280nm值，并电泳检测总RNA质量。

1.3.2 mRNA 的提取 按 Oligotex mRNA Spin-Column Kit试剂盒操作步骤进行，经过Oligo(dT)纤维素柱纯化提取mRNA，电泳检测mRNA分布及mRNA的A260nm和A280nm的比值。

1.3.3 dsDNA的合成 以mRNA为模板，以oligodt50为逆转录引物，反转录合成cDNA第一链(ss cDNA)，在RNaseH及DNA polymeraseⅠ的作用下，合成cDNA第二链(ds cDNA)。取5 μl合成的 ds DNA产物，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测ds cDNA分子量分布情况。

1.3.4 cDNA片段的加工及分离 首先使用DNA polymerase补平cDNA缺口，连接Eco RⅠ适配子，Eco RⅠ末端磷酸化，XhoⅠ消化，使合成的ds cDNA成为Eco RⅠ/XhoⅠ双黏性末端，以便定向克隆。按分子克隆的方法［7］低熔点琼脂糖凝胶电泳去掉多余接头和500 bp以下的片段，凝胶回收大于500 bp的片段，将cDNA沉淀纯化后用于连接。

1.3.5 cDNA与载体连接及滴度测定 cDNA与Uni-ZAP XR载体连接，使用GigapackⅢ Gold Packaging Extract对连接产物进行体外包装，梯度稀释后感染宿主菌XL1-Blue MRF’，37℃培养过夜，计数噬菌斑，计算滴度(噬菌斑数/ml噬菌体)。

1.3.6 cDNA重组率及插入片段大小的PCR鉴定 包装后噬菌体和辅助噬菌体加入到XL1-Blue-MRF’细胞，体外切割，释放pBluescript SK噬粒，感染SOLR细胞，涂布LB-ampicillin琼脂平板，37℃倒置培养过夜。根据平板上生长菌落数及白斑数，计算插入率及有效噬粒滴度，从平板上挑选16个白斑，以噬粒多克隆切割位点两侧序列T3和T7作为引物，PCR扩增，35个循环后电泳检测，计算平均插入片段的大小。

2 结果

2.1 总RNA的抽提

法国梧桐花粉总RNA A260nm/A280nm的比值为1.904，终浓度为 0.693 μg/μl，提示产物纯度较高，电泳结果有明显的28S和18S条带(见图1)，无拖尾现象发生，提示RNA无降解，质量合格，可以进行mRNA分离的实验。

图1 法国梧桐花粉总RNA电泳图Figure 1 Electrophoresis of total RNA from Platanus acerifolia pollen

2.2 mRNA 分离

总RNA纯化后所得的mRNA电泳结果显示，mRNA的A260nm与 A280nm的比值为1.921(见图2)，终浓度 0.203 μg/μl，说明 mRNA 足够纯净，完全符合逆转录要求。

图2 法国梧桐花粉mRNA电泳图Figure 2 Electrophoresis of mRNA from Platanus acerifolia pollen

2.3 双链cDNA合成

以mRNA为模板反转录合成ds cDNA，然后琼脂糖凝胶电泳检测，ds cDNA呈弥散分布(见图3)，条带正常，且量足。

2.4 文库滴度的测定

双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接包装后，测得的文库滴度为3.5×106pfu/ml，文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选该cDNA文库的阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后，扩增出的片段主要集中在0.25-2 kb之间，经凝胶成像及分析系统(UVP公司)分析，平均插入片段长度约为0.7 kb，插入达到94%(见图4)，结果说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。

图3 法国梧桐花粉双链cDNA琼脂糖凝胶电泳图Figure 3 Agarose gel electrophoresis of ds cDNA from Platanus acerifolia pollen

图4 法国梧桐花粉文库cDNA插入片段的PCR产物电泳结果Figure 4 PCR results of inserted cDNA fragments of Platanus acerifolia pollen library

3 讨论

由IgE介导的Ⅰ型变态反应疾病如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮肤病等影响了世界25%的人群［8］。变应原SIT是唯一针对病因治疗的有效方法，但传统SIT用天然变应原提取液的成分非常繁杂，包括致敏蛋白组分，非致敏蛋白组分及杂质等，影响其安全性和疗效。随着分子生物学技术的发展，重组变应原是目前国内外变应原研究的热点［9］。重组变应原不仅可以提高诊断的敏感性与特异性，而且还可以确保SIT的疗效及安全性［11］。国内学者对螨虫重组变应原开展了深入的研究［12，13］，我们课题组一直从事重组花粉变应原的相关研究，本研究构建法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库，为进一步制备重组法国梧桐变应原疫苗奠定了基础。

法国梧桐又称二球悬铃木，为落叶乔木，属悬铃木属，原产于欧洲，我国于20世纪60年代后大量栽培行道、公园、庭院等绿化树种，目前广布各地，花期为4月中旬至5月上旬，花粉产量很大，风媒传播，在花期空气中花粉含量很高，是大部分地区重要的吸入性花粉变应原。在西班牙，法国梧桐花粉的花期可检测到大量法国梧桐花粉，几乎占到花粉总量的14%;1997年Varela等［10］根据悬铃木属花粉变应原皮肤点刺试验、sIgE测定及免疫印迹等资料提出悬铃木属是马德里地区花粉过敏的重要致敏原;官玲燕［4］等检测汕头地区儿童哮喘患者的变应原皮肤点刺试验，发现法国梧桐花粉的阳性率仅次于屋尘螨及粉尘螨，是当地儿童哮喘患者最主要的花粉致敏原;我们的研究［6］也发现变态反应疾病患者法国梧桐花粉的皮肤点刺试验的阳性率仅次于蒿属花粉，是西安地区主要的气传花粉变应原。因此，研究法国梧桐花粉变应原基因序列，寻找适合用于脱敏治疗的变应原基因克隆，制备重组变应原疫苗用于法国梧桐花粉过敏患者的脱敏治疗，具有重要意义。

构建高质量的cDNA表达文库的首要条件就是获得完整、不被降解的总RNA。我们利用Trizol法抽提法国梧桐花粉总RNA，经分光光度计测定A260nm和 A280nm的比值为 1.904，提示产物纯度较高，电泳结果有明显的28S和18S条带，无拖尾现象发生，提示RNA无降解，质量合格。高质量的mRNA也是构建高质量的cDNA文库的前提。本实验的总RNA经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后，得到mRNA，纯化后所得的mRNA的A260nm和A280nm的比值为1.921，说明mRNA足够纯净，完全符合逆转录要求。

重组子插入片段的大小是评价文库质量的标准。我们采用凝胶过滤对cDNA进行分离，除去未被利用的接头-衔接子以及由限制性内切核酸酶消化接头多聚物所生成的低分子量产物，及一些长度小于500 bp的短片段。从文库中除去这些片段不仅减少了必须筛选的重组子的数目，同时还增加了文库中全长目的mRNA的数量，保证了文库的质量。我们随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR扩增，经分析平均插入片段长度约为0.7 kb，符合建库要求，为筛选出全长目的基因提供保证。

足够大的库容量是保证筛选目的基因的关键。低丰度mRNA在cDNA文库中出现的某一给定概率所需克隆数为N=ln(1-P)/ln(1-1/n)(N为所需克隆数，P为要求的概率，1/n为低丰度mRNA在总mRNA中所占的比例)，若要以99%的概率获得这些低丰度的克隆，则要求的文库克隆数为1.7×105，我们所建的表达文库滴度为3.5 ×106pfu/ml，已超过了这一标准，适合用于目的克隆的筛选。

总之，我们构建的法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库达到设计要求，适用于进一步进行法国梧桐花粉主要变应原目的克隆的筛选，为制备重组法国梧桐花粉变应原疫苗奠定了基础，也为提高变态反应疾病诊断的特异性和敏感性以及特异性免疫治疗的疗效和安全性奠定了基础。

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