植物细胞程序性死亡中的半胱氨酸蛋白酶的研究进展

王东方

(潍坊学院山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东潍坊261061)

细胞程序性死亡(Programed cell death，PCD)是动植物由自身基因调控的细胞自主、有序的死亡方式［1］。PCD不仅是一类特殊的细胞死亡方式，而且对动植物本身来说具有独特的意义。随着分子生物学的发展以及生物技术的进步，细胞凋亡的有关研究不仅在动物和医学中深入开展，而且PCD研究也在植物学中广泛展开，成为植物学研究的热门领域。有关研究表明，在众多的环境胁迫如干旱、高低温及盐碱胁迫下合成半胱氨酸蛋白酶的mRNA会逐渐积累且增多［2－3］，在植物发生PCD的过程中半胱氨酸蛋白酶mRNA也会增加。这说明半胱氨酸蛋白酶(Caspase)与植物发生PCD有密切关系［4］。

1 Caspase的基本结构和分类

半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase)是一类与生物细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶，是富含半胱氨酸的一类蛋白酶家族。它们的活性位点均含半胱氨酸残基，能够在特异天冬氨酸残基肽键部位进行切割，造成细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族系列是细胞进行死亡机制的主要“调控者”。Caspase蛋白酶组被刺激激活后，启动细胞死亡程序，导致细胞进入死亡调控的执行阶段［5］。Caspas是由两个前体合成的，前体是由两个亚单位组成的异二聚体，每个功能性Caspase都是由两个前体的结合形成，然后形成异四聚体。Caspase的激活经过两次在天冬氨酸羟基端的肽键部位裂解，经裂解后蛋白酶前体被切割成三部分，其中第一部分称为抑制区域，即断裂后的H2N-端，当被切断后丢失，另外两部分是死亡区域，即COOH-端断裂后分成大小两个亚单位，断裂的大小亚单位嵌合组成一个以p片层构成的核心，d螺旋在其两侧，由两大两小亚单位进一步结合成活化酶。该四聚体在所对应的两端有两个活性位点，可作用于其本身及其他Caspase酶原，依照一定次序依次激活Caspase，形成酶级联反应［6－7］。

Caspase家族包括许多种，多数与细胞程序凋亡有关，有些与炎症反应相关联［8］。根据功能、位置，可将Caspase家族大致分为两种类型:I型Caspase，又称为启动型Caspase(Initiator Caspase)，包括 Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等，存在于Caspase级联反应的最上端，在辅助蛋白因子的辅助下进行活化并激活下端的Caspase;Ⅱ型Caspase，又称为执行型 Caspase(Executioner Caspase)，包括 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，其功能是特异性地使底物裂解，使细胞发生形态以及生理生化变化，致使细胞凋亡。此外，还有一类 Caspase(包括 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-13、Caspase-14等)，主要功能是与细胞因子介导的炎症反应有关，同时在细胞程序性死亡过程中起辅助作用［9］。

2 Caspase参与植物PCD的过程

Caspase的研究最早开始于线虫(C．elegans)细胞程序化死亡的相关研究。Caspase是动物程序死亡进行启动及执行阶段的关键调控因子，在植物中虽然没有分离得到Caspase基因，但是在植物细胞死亡过程中检测到Caspase活性的提高。已有研究表明，植物细胞凋亡过程中Caspase活化，推测其分子结构与动物不同，在PCD中执行的功能也可能不同［10］。用动物Caspase活性分析试剂盒检测湖北海棠根系，发现存在Caspase-3或Caspase-7活性［11］。在研究平邑甜茶及新疆野苹果的细胞程序性死亡时，免疫印迹试验表明在干旱胁迫条件下两种砧木叶中都含有类Caspase-3蛋白酶，而根中不存在，通过Western bolt检测出类Caspase-3的分子量约40 kD，比动物高8 kD左右［12］。

2．1 植物Caspase的种类 基因序列分析研究证明，在拟南芥基因组中没有检测到编码Caspase酶类的基因，但是在正在死亡的植物细胞中可以检测到Caspase活性的升高，表明植物细胞程序性死亡进程并非是Caspase，而是与Caspase有类似酶活性的其他类型的蛋白酶有关。基因组序列比对证明，在植物的某些序列编码的蛋白酶中与Caspase在空间结构上具有一定的相类似的特性，并且可被Caspase酶类抑制剂抑制其活性。烟草原生质体用menadione诱导细胞程序性死亡的研究表明，抑制剂Ac-DEVD-CHO和Ac-YVADCHO能抑制Caspase活性，阻止DNA的断裂和PARP(poly-(ADP-ribose)polymerase)的降解［13］。目前，植物中已鉴定出的半胱氨酸蛋白酶可以分为三类，其中豆类中天冬氨酸蛋白酶(1egumain)家族的液泡加工酶(vacuolar processing enzymes，VPEs)和metacaspase属于半胱氨酸内肽酶，与Caspase具有类似的氨基酸序列及空间结构，是Caspase的同系物;丝氨酸内肽酶(saspases)是枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，能分解人工合成的Caspase底物。最新的研究表明，saspases、VPEs、metacaspase在植物细胞程序性死亡过程中均起类似Caspase酶类的重要调控作用，参与调节、控制与执行植物细胞程序性死亡。

2．2 动植物Caspase的异同 植物半胱氨酸蛋白酶与动物细胞凋亡过程中Caspase蛋白酶类似，也介入植物细胞程序性死亡的调控过程及环节。Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)参与H2O2诱导的植物PCD，而植物PARP的降解依赖于细胞色素C释放到胞质中，可被特异地Caspase-3抑制剂所抑制［14］。

动物和植物细胞中的半胱氨酸蛋白酶的区别主要有以下两点。①存在部位不同。植物Caspase存在于细胞壁和液泡，而且叶绿体中的半胱氨酸蛋白酶可以降解糖1，5-二磷酸核酮羧化酶(Rubisco)，而有酶活性的动物Caspase蛋白只存在于细胞质中，液泡中不存在。②同源性较低。研究表明，植物细胞中的半胱氨酸蛋白酶包括基因序列和蛋白质结构及功能同源性均比较低，而动物Caspase蛋白家族相比就高得多。所以，相关学者对植物中是否真正存在由半胱氨酸蛋酶参与的PCD调控机制还持有不同观点。

2．3 植物Caspase及其编码基因 虽然半胱氨酸蛋白酶家族被外界有关信号激活机制以及参与调控细胞死亡的具体调控进程还不明确，但关于Caspase的研究，已经从许多植物中成功地得到其编码基因。根据植物半胱氨酸蛋白酶的基因表达特点，可将其分为以下三类。

一是存在于植物正常发育阶段中或存在植物某些特殊时期所表达的半胱氨酸蛋白酶。Carne等［15］从中华猕猴桃(Actinidia chinensis)中获得一种半胱氨酸蛋白酶，测定其氨基酸序列，即actinidain。Ryan等［16］在研究杏树果实成熟时发现一个编码半胱氨酸蛋白酶基因的高度表达，成功提取其mRNA。这为今后的研究提供基础。Lee等［17］试验获得水稻半胱氨酸蛋白酶基因OsCP1，发现OsCP1基因在水稻未成熟的花药中表达，通过T-DNA插入突变体分析表明Caspase基因OsCP1主要参与水稻花粉的生长发育过程。严秀蕊等［18］在水稻发育过程中发现Caspase酶相关基因OsCP2，结果表明它也在水稻未成熟的花药中及花药绒毡层，且只在花粉发育的空泡花粉时期到成熟时期进行表达。张红岩等［19］采用SSH(Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR(Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到来自油菜(Brassica napus L．)矮化突变体‘NDF-1’的一个半胱氨酸蛋白酶相关基因Bncp5;RT-PCR检测表明，该基因具有植物组织中表达特异性。Tripathi等［20］在玫瑰花瓣脱落过程中发现转录激活一个37 kD的伴随乙烯反应的半胱氨酸蛋白酶基因Rb-CP1。该基因与蛋白质的降解过程密切相关。张国林等［21］在花生果种皮中发现一个半胱氨酸蛋白酶基因AhPSG13。RT-PCR检测表明，该基因在果种皮中表达特异性。

二是在生物胁迫和非生物胁迫条件下产生的半胱氨酸蛋白酶。在对拟南芥的逆境研究中，发现RD(Responsive to dehydration)系列基因包括 rd19A、rd21A以及 rd29A/cor78/lit78［22］。RD系列基因已成为植物逆境研究中的关键点，对于逆境信号传导通道的交叉研究具有重要意义。Rossano等［23］发现在水分胁迫下，利用RACE方法得到小麦Caspase基因TaCP(AY841792)。朱家红［24］在橡胶树树胶乳中克隆获得一个半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1;半定量RT-PCR结果显示，通过乙烯伤害诱导胶乳HbCP1基因的表达，推测胶乳中的HbCP1蛋白可能具有防御功能。曹慧等［25］在研究苹果砧木八棱海棠中也分离得到了Caspase基因。

三是在衰老的植物组织中Caspase表达量增加或在衰老时期半胱氨酸蛋白酶特异性表达。衰老是指生物体在进行生命活动、生理代谢过程中，随着时间的增加，生物体细胞增殖分化能力、生理功能等逐渐发生衰退的变化过程。衰老是生物内在因子调控的结果，最终导致细胞逐渐死亡，有时将衰老视为程序化死亡过程［26］。在各种衰老的植物组织中分离获得许多调控半胱氨酸蛋白酶的基因，都被称作衰老相关基因SAG(Senescence associated genes)，如拟南芥的SAG2和SAG12，玉米的 See1 和 See2，油菜的 LSC7 和 LSC790［27］，番茄的Cyp23和烟草的NTCP223［28］。这些基因在衰老的叶片中均过量存在。王勇等［29］在大豆叶片衰老过程中发现了一个半胱氨酸蛋白酶相关基因，它在衰老的叶片中特异性表达。沈法富等［30］从棉花衰老叶片中克隆了编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA，被称为Ghcysp(AY604196)。研究表明，该基因在棉花的花中、根部、下胚轴及幼叶等生长旺盛部位中不表达，而在棉花的衰老叶片中特异性表达。King等［31］研究表明，在花椰菜花瓣衰老过程中半胱氨酸蛋白酶显著表达。朱海生等［32］在草莓中克隆取得半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，并且发现FaCP基因表达量随着衰老程度的增加而逐渐增加，尤其是在衰老后期显著上升。

3 结语

半胱氨酸蛋白酶家族介入了植物生长和发育过程中蛋白的降解，在种子萌发、果实发育及成熟、器官衰老与脱落等生理活动进程中起重要作用;介入响应外界病菌侵入时的超敏反应;也与植物木质部分化有关，并和器官衰老引发的PCD相关联。半胱氨酸蛋白酶系列基因不但参与植物的衰老调控，而且参与信号传导，并响应外界环境中的生物和非生物胁迫［14，33］，但在植物对外界非生物胁迫和生物胁迫的响应以及器官分化和衰老的过程中，Caspase的功能、作用研究才刚开始。与动物Caspase的研究相比，在植物中的有关功能机理还需要进一步研究。有关植物细胞程序性死亡Caspase类蛋白酶的研究尚处于起始阶段。随着细胞凋亡研究的不断深入，植物细胞Caspase功能与程序性死亡关系的研究将会进入一个新阶段，从而进一步揭示植物细胞程序性死亡中Caspase酶类作用机理和机制。

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