纳米磁性载体在固定化漆酶技术中的应用

袁炳楠，董其飞，陈 成，郭明辉　(东北林业大学生物质材料科学与技术教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040)



纳米磁性载体在固定化漆酶技术中的应用

袁炳楠，董其飞，陈 成，郭明辉*(东北林业大学生物质材料科学与技术教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040)

漆酶又称苯二酚氧化酶。19世纪80年代日本学者田彦六郎首次在紫胶漆树的树液中发现一种能使树漆氧化、硬化的酶。目前，已有超过20种不同来源的真菌漆酶可以实现提纯。漆酶具有高效的低温下催化性和底物专一性，皆为糖蛋白单体酶。酶分子中存在3个铜离子结合位点，一般都结合有4个铜离子。在进行催化反应时，位于活性结合位点的铜离子从底物吸收电子，使底物氧化形成自由基，进而依次发生次级反应，实现催化效果，而所吸收的电子会使漆酶分子上的氧被还原生成漆酶催化反应的唯一产物——水。正是由于漆酶的反应条件温和，催化效率高，它受到广泛关注。然而，与大多数酶一样，其最适反应条件具有局限性，易失活且生产成本高，因而漆酶的使用受到一定的限制。于是，在20世纪60年代初期，固定化酶技术应运而生。

1固定化漆酶技术

所谓固定化酶技术，是指利用物理或化学等手段将游离的酶与适当载体相结合，将其固定在一定的空间区域内，并且保持活性，使酶的使用范围更加广阔的方法。固定化酶技术具有以下优点：①使酶的活性更不易受pH、温度等外界因素的影响，最适范围更广；②使酶更容易从底物中分离出来，可以回收，并重复使用，大大增加酶的利用效率，降低使用成本；③反应条件要求降低，使酶可以更适应连续的、自动化的工业生产；④实现更多种类的酶同时进行酶促反应。经过50余年的发展，目前固定化酶技术已广泛地应用于食品工业、医药合成、工业发酵、细胞工程、环境保护、结构研究和生物合成等诸多领域。其中，用于酶固定化处理的载体主要可以分为天然高分子载体、合成高分子载体、无机载体和复合载体四类。天然高分子载体主要有壳聚糖、甲壳素、琼脂等，具有无毒、易结合、易分解、强度差等特点。合成高分子载体常见的有聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯醇，普遍具有机械强度大的特点。无机载体主要有SiO2、TiO2，具有稳定性好、强度高、无毒、成本低、寿命长等诸多优点。而复合载体则是将以上3种载体中的若干相结合，使其优点兼具，如活性炭聚丙烯酸酯复合载体[1]。目前，最多的是将有机或无机载体与磁性微粒相结合，形成磁性复合载体，如磁性壳聚糖载体、磁性SiO2、介孔SiO2/Fe3O4载体[2]。

2纳米磁性复合载体

纳米磁性复合载体是随着纳米技术的飞速发展衍生而出的一种新型固定化酶载体，是指在传统载体的基础上加入磁性中心，并将载体的尺寸缩小至纳米量级。纳米磁性复合载体兼具单一类型载体的各种优点，又可以利用外加磁场进行快速分离、回收，使得纳米级的磁性载体成为各相关领域的研究热点。

2.1介孔SiO2/Fe3O4磁性载体介孔SiO2/Fe3O4磁性载体以合成的纳米Fe3O4为磁性核心，外面包覆SiO2形成核壳结构，其中SiO2表面具有多孔结构，其尺寸在介孔材料范围。按照国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，介孔材料的孔径应在2～50 nm，具有高比表面积，孔道规则、均匀、有序，因而具有诸多微观特性。1992年Mobi公司的研究人员们首次运用纳米结构粒子组装技术制备出具有均匀孔道、孔径可调的介孔二氧化硅(MCM-41)[3]。其孔径及形貌单一可控，比表面积高可达1 000 m2/g，孔体积大。丰富、规则的多孔和孔表面的官能团非常适合漆酶附着固定。目前，以中空的核壳结构介孔性能最佳。张红等[4]以正硅酸乙酯为硅源，以Fe3O4为核心，以甘油和水形成的浊液为溶剂，利用溶胶凝胶法制得粗载体，再在500 ℃下热处理3 h以缩小孔径合成介孔SiO2/Fe3O4磁性载体。利用物理吸附的方法，使得漆酶黏附在载体，得到的漆酶表面活性和操作稳定性得到显著提高。Xie等[5]以中空的Fe3O4为核心得到相似的结构。而王苗苗[6]先以SiO2亚微球为核心，表面包覆β-FeOOH，然后利用NaOH溶液去除SiO2，得到中空的β-FeOOH微球，再利用TEOS在碱性条件下的水解，以CTAB为结构模板对其进行包覆，最终得到中空的介孔β-FeOOH/SiO2磁性微球，采取相似的方法得到介孔SiO2/β-FeOOH/SiO2磁性载体。结果表明，中空的磁性微球单位质量下固定漆酶的量比传统实心微球更大，其比表面积大，密度更低。显然，介孔载体材料由于其规则、有序以及可控的孔隙，它具有其他载体所没有的特性，但是也使得其制备过程更加复杂，需要更精细的控制，并且不适合大规模的自动化工业生产。

2.2非介孔SiO2/Fe3O4磁性载体与介孔材料不同，非介孔SiO2/Fe3O4磁性载体是以无机材料SiO2将磁性中心(Fe3O4)完全包裹形成核壳结构，按照不同的固定化方法对表面包裹的SiO2进行化学修饰，使之可以与漆酶结合实现固定化处理。罗开昆[7]利用硅烷偶联剂包埋法制备多型载体，研究了SiO2、巯基丙酸、巯基丙酸酰胺-乙酰等同包裹材料的固定效果，得出最佳材料。刘宇等[8]以加入柠檬酸三钠和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方法改进了共沉淀法制备的 Fe3O4纳米颗粒，使其分散性更佳；又通过其改良的溶胶-凝胶法制备出分散性较好的磁性 SiO2，以硅烷偶联剂氨基化处理配合戊二醛固定化漆酶，得到较好的效果，并且研究最佳试验条件。该种方法利用化学键结合漆酶，结合强度大，是最稳定的固定化方法。

2.3螯合铜离子的SiO2/ Fe3O4磁性载体螯合是由中心离子和满足一定条件的多齿型配位体的两个或两个以上配位原子形成的具有环状结构的配合物的作用过程。螯合物属于配合物的一种，是具有环状结构的配合物，具有明显的热力学稳定性和热稳定性。贺芙蓉等[9]在碱性条件下的十二烷基磺酸钠水溶液中采用共沉淀法制备了Fe3O4，在Fe3O4悬浊液中利用TEOS在碱性条件下水解的反应使生成的SiO2直接包覆在Fe3O4表面，得到磁性载体。Cetinus等[10]以γ-氯丙级三甲氧基硅烷将表面的SiO2硅烷化，并与PAM反应结合，最后加入CuSO4，制备表面螯合铜离子的SiO2/Fe3O4磁性载体。同时，研究了利用固定化后的漆酶对水中2，4-二氯酚的降解效果，得出最适pH和底物浓度以及Cu2+浓度对漆酶固定化效率的影响，得出0.2 mol/L的最佳浓度[11]。这种螯合铜离子的SiO2/ Fe3O4磁性载体是令漆酶以配位键的形式固定，热稳定性较好，而且克服采取交联法和共价键结合法由于反应条件较剧烈导致漆酶活性降低的缺陷，避免对漆酶天然高分子结构的损伤，保持漆酶的活性和高催化性。螯合物本身又具有一定磁效应[12]，提高漆酶使用后的磁性分离效果。

2.4壳聚糖+ Fe3O4磁性载体壳聚糖是一种自然界广泛存在的天然高分子，具有生物安全性、强吸附性、生物降解性和抑菌性等多种优秀特性，在酶的固定化领域也有广泛应用。早在1996年，钱国强等[13]以壳聚糖微球固定L-天门冬酰胺酶，获得较高的回收率。随着各种磁性载体的相继出现，壳聚糖磁性载体由于其具有天然、无毒、易降解等特点受到关注。有研究表明，以戊二醛为交联剂，利用反向悬浮法制备具有良好的机械性能、稳定耐热、尤其是不受金属离子干扰优点的磁性壳聚糖微球，并将之用于漆酶的固定化处理，从而实现连续化和工业化生产。通过加入亲水性单体——戊二醛，采用单体聚合法以戊二醛为交联剂合成核壳结构的壳聚糖磁性载体，利用其固定的漆酶在催化肾上腺素的试验中效果显著。

2.5聚苯乙烯+ Fe3O4磁性载体合成高分子载体具有成本低、制备简单快速、稳定性好、耐酸碱、可以使用较苛刻的环境等诸多优点。曹阳等[14]以聚苯乙烯和二氯甲烷为油相，以十二烷基苯磺酸钠为表面活性剂，Fe3O4处理，制备纳米聚苯乙烯磁性载体，研究温度、搅拌速度和pH等对磁性微球形貌、尺寸和磁学性能的影响，并且得出最佳实验条件。

2.6四氨基金属钛箐+ Fe3O4磁性载体酞菁(Pc)类化合物的分子具有较大的共扼体系。这使其具有较好的热稳定性、化学稳定性、耐燃烧性、耐酸碱性。由于金属酞菁(MPc)中的金属离子周围的轨道存在空穴，可以与带有孤对电子的原子或离子形成配位键。它所带有的四氨基有利于酞菁类化合物通过氨基进行次级化学反应。Fe3O4纳米粒子表面的O离子带有孤对电子，并且处于活化状态，因而在一定的条件下MTAPc可以和Fe3O4纳米粒子以配位键复合，形成MTAPc/Fe3O4复合粒子，从而提高Fe3O4纳米粒子的稳定性能，防止其氧化，同时复合载体并不影响纳米Fe3O4，仍具有超顺磁性，又可以利用氨基与各种生物分子交联。还有研究表明，以Cu为配位体金属，制备四氨基Cu钛菁包覆Fe3O4的磁性载体，并且利用其成功地固定漆酶。通过检测，发现所制得的磁性载体性能优异，在热稳定性、抗氧化性、溶解性和贮藏稳定性等方面均较好。

3结语

漆酶作为一种天然生物酶，催化效率高，催化产物为完全无污染的水。它是一种非常环保的酶类，在降解污染物、生物科学、化学等诸多领域都有巨大的应用价值。纳米磁性载体固定化漆酶技术不仅使得漆酶可以适用于更加广泛的物理条件，而且使得漆酶在使用后可以进行快速分离，并且回收利用。这大大提高使用效率，降低使用成本。目前，各类型磁性复合载体的研究已较全面。未来的发展方向之一就是如何将磁性载体固定化漆酶这一工艺操作自动化，如何批量地对漆酶进行固定化处理，并且保证使用后的回收率足够高，成本足够低，使固定化的漆酶可以进行工业化的生产和使用。

参考文献

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摘要漆酶是一种具有高效催化效用的氧化酶。它的催化产物为水，完全不对环境产生任何污染，因而其利用受到各方研究人员越来越多的关注。近年来，随着新型材料、环境保护等相关领域的高速发展，大量高质量、高性能的材料在固定化漆酶方向得以应用。纳米磁性复合载体就是其中一种。它在回收循环利用、提高利用效率以及扩大漆酶可使用条件方面的效果明显。

关键词固定化漆酶；磁性载体；应用

Application of Magnetic Nanoparticle Composite Carriers in Immobilized Laccase

YUAN Bing-nan, DONG Qi-fei, CHEN Cheng, GUO Ming-hui*(Key Laboratory of Biomass Materials Science and Technology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

AbstractLaccase as a kind of oxidases, which has a high efficiency catalysis. And its catalysate is H2O that means laccase is absolutely without any polluted. So, more and more attentions have being paid on laccase because of this. In recent years, with the rapid development of the researches in materials, environment, and other related areas, growing numbers of new and high quality materials have been made into the carries of immobilized laccase. The magnetic nanoparticle composite immobilized the free-state laccase is a kind of the new materials, which has a good effect on improving its utilization factor, recycling and expanding usable conditions.

Key wordsImmobilized laccase; Magnetic carriers; Application

收稿日期2015-04-29

通讯作者

作者简介袁炳楠(1992- )，男，黑龙江哈尔滨人，本科生，专业：木材科学。*，教授，博士生导师，从事生物质复合材料方面的研究。

基金项目林业公益性行业科研专项(201404506)；东北林业大学大学生院级创新训练计划项目(CL2014020)。

中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)18-022-02