水稻贮藏特性与籼粳基因型的关系

刘 霞 杜雅荣 李喜宏 马 文 王 威 刘香军 高玉敏 李丽秀

（天津科技大学食品工程与生物技术学院1，天津 300457）（国家农产品保鲜工程技术研究中心2，天津 300384）（南开大学生命科学学院3，天津 300071）（天津捷盛东辉保鲜科技有限公司4，天津 300300）

水稻贮藏特性与籼粳基因型的关系

刘 霞1，3，4杜雅荣1李喜宏1马 文1王 威1刘香军1高玉敏1李丽秀2

（天津科技大学食品工程与生物技术学院1，天津 300457）（国家农产品保鲜工程技术研究中心2，天津 300384）（南开大学生命科学学院3，天津 300071）（天津捷盛东辉保鲜科技有限公司4，天津 300300）

实现以PCR为基础的水稻种质的耐储藏性检测，将大大加快水稻及其他粮食作物耐储藏品种的培育和推广。本研究首先使用12个籼粳特异性PCR标记对育种与生产中常用的35个籼粳稻进行基因型鉴定，然后，依据基因型信息的聚类分析，将不同籼粳基因型水稻分为籼型、偏籼型、偏粳型和粳型共4类。结果表明，籼型和偏籼型品种老化指数均小于50%，而偏粳型和粳型水稻材料则大多不耐储藏或储藏性较差，偏粳型材料较粳型材料耐储藏性好，并且储藏后粳稻的总酸变化较剧烈。利用籼粳特异性标记的籼粳基因型分析与籼粳型态指标结合可以快捷、简便而有效的鉴别特殊的耐储藏品种，为耐储藏品种筛选与育种提供基础。

水稻 籼粳性 储藏 基因型 陈化

我国60%左右的居民以大米为主食，但是，现阶段缺粮10%以上，其中采后损失高达5%（包括食用和种子用），造成上百亿元／年的经济损失。长期以来，人们一直习惯气调、温调以及使用药剂等传统手段改善稻谷的贮藏性能，但也带来了贮藏成本及药剂残留等问题，而且气、温的调控对占我国粮食贮藏总量70%～75%的农家散户很难实行。相比而言，培育水稻耐贮藏品种是粮食贮藏中更为有效的方法与手段，其中，从基因水平诊断水稻种质的耐贮藏性能，通过“Breeding by design”［1］（设计育种）技术能够更快地实现耐贮品种快速创生的目标、加快选择耐贮藏种质的速度。

90年代初日本率先开展了水稻耐贮藏领域的研究，但目前为止，国内外多集中在杂交稻种子活力表现及其测定、各种贮藏条件下水稻理化性质的变化规律方面的研究，仅有少数论及水稻种子活力与其基因型有关的报道，但鲜见深入研究。稻谷耐贮藏性在品种间具有丰富的多态性，不同亚种间的耐贮藏性分别为籼稻＞爪哇稻＞粳稻，通过鉴定不同种质的耐贮藏基因，进而聚合耐贮藏相关基因，可有效改善水稻品种的耐贮性［2－3］。

稻米的陈化是一个复杂的过程，已鉴定了一些水稻耐贮藏 QTL位点［4－7］。然而，造成亚种间耐贮藏性差异的机制至今鲜见报道，关于水稻耐贮藏性与基因型结合的研究也鲜见深入开展。本研究旨在通过不同水稻品种自然老化处理，在综合考察籼粳基因型的基础上，比较不同基因型水稻的耐贮藏特性，研究不同基因型水稻的贮藏品质变化规律，阐明稻谷贮藏特性与籼粳基因型的关系，为进一步开展水稻耐贮藏性的分子诊断与陈化机理研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

水稻材料于2006年广州市农业科学院水稻试验基地（北纬 23°05′32″，东经 113°20′55″）进行种植。用于本研究材料随机区组设计，3次重复种植，25 cm×15 cm行列间距。本研究所使用的水稻材料见表1。

材料于2006年11月收获，收获后测定各指标的初始值，并将不同水稻材料分别贮藏于网袋中，常温自然贮藏30个月后测定水稻的各项理化指标，以进一步分析不同水稻品种的耐贮藏性。

表1 供试水稻材料

PCR引物：上海申能博彩生物有限公司；琼脂糖：美国伯乐（BIO－RAD）有限公司。

PCR仪、凝胶成像系统：美国伯乐（BIO－RAD）有限公司；DYY－6C型电流仪：北京六一仪器厂；小型精米机：日本凯特KETT公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

水培产生的水稻幼苗叶片采用CTAB法进行DNA提取［8］，提取好的DNA用水溶解后贮存于－20℃。

1.2.2 PCR分析

1）引物：水稻籼粳稻异性引物见表2，由上海申能博彩公司合成。

2）反应体系：PCR反应体系20μL，包括2μL 10 X缓冲液，100 ng模板，2μL dNTP（2.5 mmol／L），0.13 μL Taq酶，3μL 3’、5’引物（5μmol／L）及双蒸水。PCR反应中的dNTP、Taq酶等均为申能博彩产品。

3）反应程序：94℃预变性 2 min；94℃ 30 s，55℃（或58℃）30 s，72℃ 30 s，35个循环；最后进行72℃延伸10 min，4℃保存。

4）PCR产物检测：取8μL反应产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统进行拍照。

1.2.3 基因型与聚类分析

6对籼粳特异性SSR引物通过236对SSR标记对35个典型籼粳水稻品种的基因型分析筛选得到。SSR引物序列信息来自 Gramene数据库（http：／／www.gramene.org），所使用引物均匀分布于水稻12条染色体上。其他6对籼粳特异性PCR标记由28个籼粳特异性RFLP标记［9］中的5个籼粳检测率较高的标记转换得到。用于水稻耐贮性分子诊断的引物序列信息见表2。

依据不同分子标记35个水稻品种中的基因型信息，进行35个水稻品种的聚类分析，采用NTSYSpc 2.0 for window进行。

表2 水稻耐贮性分子诊断的引物序列信息

1.2.4 水稻品质分析方法

以下项目的分析测定的样品为新鲜或贮藏后稻谷通过小型精米机制备。分析项目和方法为：水分按 GB／T 5479—1985（105℃恒温法）执行；酸度按GB／T 5517—1985执行。

1.2.5 老化指数

用老化指数表示种子耐贮藏特性，老化指数越高越不耐贮藏。

老化指数＝［（未老化发芽率－自然老化后发芽率）／未老化发芽率］×100%

1.3 数据处理与分析

全部试验数据采用SPSS 19.0软件进行统计处理和检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 籼粳基因型与老化指数的相关性

经过长期的籼粳分化、自然选择和人工选择，水稻的籼粳分化是深入和复杂的。稻谷贮藏特性与籼粳特性之间存在极显著的相关［10］。本试验利用筛选出的12个籼粳特异性标记对35个水稻品种进行基因型分析，依据基因型特异信息的聚类结果将35个水稻品种按亲缘关系分为籼粳2个亚组（图1）。

由籼粳聚类分析可知，粳稻组中，1187、津原36、W45、9204、越富、农林 29、341B、朝 8、日本晴、花育 446、花育409为典型的粳稻，亲缘关系较近。津原38、9618－1、越光、津原101、8923和903为另一种类型的典型粳稻，这2组典型粳稻是经过长期的自然选择和人工选择分化出粳稻亚种的多态性。辽恢253、C602和C418属于粳稻亚种，但其与典型粳稻相比这些粳稻基因组中包括了籼稻基因组成分，是籼粳杂交的桥梁品种。籼稻组中 IRBB60、桂99、矮脚南特、唐164、9311、の川、明恢63、珍汕97A、E32和广东3号为典型的籼稻品种，与粳稻品种间多态性相比籼稻品种间的多态性较高。丰源B、川A和川B在育种过程中形成了特有的多态性特征，与其他籼稻相比具有独特性。

根据聚类结果分析可将35份材料分为籼型、偏籼型、偏粳型和粳型4种类型（表3），分别有10、4、4和17份。每种籼粳类型水稻组间老化指数存在极显著差异，可见与稻谷耐贮藏性相关的老化指数变化存在极大的籼粳特异性，籼型和偏籼型品种中，均未发现老化指数大于50%的材料，在偏粳型和粳型材料中，则以不耐贮藏或贮藏性较差为多，偏粳型材料较粳型材料耐贮藏性好，在粳型的17份材料中仅发现1份材料的耐贮藏性较好。

图1 35个水稻品种的聚类分析

表3 自然老化及籼粳特性分析

2.2 籼粳性对稻谷超长期储藏酸度的影响

大米中酸性物质主要由脂肪酶、植酸酶、蛋白酶等作用分解脂肪产生脂肪酸、分解磷脂产生磷酸和酸性磷酸盐、分解蛋白质产生氨基酸、分解碳水化合物产生乳酸、酪酸和醋酸［9］，品质正常的大米含有的酸性物质很少。

根据籼粳基因型与老化指数分析的综合结果，从35份材料中优选出 W45、9618、津原101、C418、矮脚南特、唐164、9311、の川和川B共8个代表性品种进行不同基因型稻谷储藏品质总酸的变化规律研究。由图2可见，新鲜的稻谷总酸值在不同品种间存在一定的差异，但变幅不大，除粳稻的津原101总酸值较小，籼稻的唐164总酸值较大，其他品种的总酸值均在0.2～0.4 mgKOH／100 g之间。比较两亚种间总酸初始值可发现粳稻品种的初始总酸值较小（粳稻总酸平均值为0.246 mgKOH／100 g，籼稻总酸平均值为0.357 mgKOH／100 g）。然而，不同基因型水稻品种在自然条件下储藏30个月后总酸均上升，籼粳稻两亚种相比，典型籼稻品种总酸增长率较偏籼型、偏粳型和典型粳稻慢（表4），其中亲缘关系较近的4个籼型稻谷唐164、9311和の川总酸变化率无显著性差异，与籼粳聚类结果一致，其总酸增长率与亲缘较远的川B和其他4个代表粳稻之间差异显著，并且粳稻之间耐储藏性差异较籼稻更为明显，各代表品种间总酸变化显著。

图2 不同基因型水稻自然贮藏30个月总酸的变化

表4 不同基因型水稻自然贮藏30个月总酸增长率的变化

现代分子生物学和分子遗传学研究表明，控制同一性状的基因具有多态性，同一基因的不同基因型在基因表达、蛋白质活性与特异性方面都存在差异。水稻耐储藏性在品种间具有丰富的多态性，不同亚种间的耐储藏性分别为籼稻 ＞爪哇稻 ＞粳稻［11］。造成种质间的耐储藏性差异的原因可能是储藏相关基因或其调控序列差异。例如Suzuki等［12］发现了LOX3缺失的水稻品种“Daw Dam”，研究表明LOX3缺失水稻脂肪酸氧化生成醛系物产量较具有LOX3水稻的品种低［13－14］。因此，初步推断造成籼粳稻两亚种总酸值差异的原因可能是籼粳稻形成酸性物质起作用的酶活性及含量的不同造成的，而这种不同可能是基因型或其调控序列的差异引起的。

2.3 耐储藏种质的诊断与筛选

根据老化指数及籼粳基因型、形态学鉴定35份水稻材料的耐贮藏性与籼粳性的相关性。水稻籼粳基因型与水稻的耐储藏性存在一定的一致性。例如粳稻品种大多数为不耐储藏品种，而籼粳桥梁品种如C418的耐储藏性较典型粳稻好。津原101是典型的粳稻，但是具有特殊基因型表现，与此相应在其储藏特性上也表现了不同于典型粳稻的耐储藏特性。因此，通过基因型可以快速、便捷地鉴定水稻耐储藏性。

籼粳形态指数与水稻耐贮藏性也具有很好的相关性，基因型鉴定结合籼粳形态指数鉴定能够更加精确的对不同水稻种质的耐贮藏性进行诊断。籼粳稻耐储藏性能比较结果表明，籼稻较粳稻耐储藏。对于特殊籼稻品种的耐储藏性鉴定，如具有特殊基因型的川B，在基因型鉴定的基础上可进一步通过快速老化试验来验证其耐储藏性。

在35份水稻材料中耐储藏性较好的粳稻有2份，其他耐储藏的水稻大多为籼稻品种。寻找籼稻耐储藏基因，通过基因聚合育种、转基因等技术可将籼稻耐贮藏基因转入优质粳稻品种中可实现优质、耐贮藏品种的培育［2］。

3 讨论

鉴定水稻耐贮种质资源，一方面可通过自然、人工老化处理鉴定，另一方面可通过分子诊断鉴定。在实践上，鉴定水稻耐储藏基因与新型分子标记是进行水稻储藏分子诊断的基础。不同亚种间的耐储藏性分别为籼稻＞爪哇稻＞粳稻，利用耐储藏基因资源培育优质、高产、高抗、耐贮品种将对我国水稻储藏水平提高起到根本性作用。

脂肪酸氧化是稻谷陈化的主要因素，脂肪酸氧化首先是脂肪在脂质降解关键酶脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，Lipase，EC 3.1.1.3）的作用下分解为甘油和不饱和脂肪酸［15－17］，脂肪酸积累启动脂肪酸氧化酶（LOX－1、LOX－2、LOX－3）氧化脂肪酸产生醛、酮等挥发性物质和氢过氧化物以及衍生物和自由基稻谷陈化变质，因此脂肪酶和脂肪酸氧化酶是稻谷陈化的关键酶，其表达量与表达效果对水稻的耐储藏性具有重要的作用。本研究发现的籼粳特异性SSR标记RM405通过Blast分析表明该标记位于脂肪酶家族基因的第三内含子内（lipase of class 3 family），粳稻较籼稻在这一脂肪酶基因内有更多的（AC）重复序列。造成籼粳稻耐贮藏性上差异的分子机理尚不明确，本研究发现的简单重复序列RM405所在区域的多态性可能是引起籼粳稻脂肪氧化差异的重要因素之一，这一结果还需进一步验证。

所谓的籼粳特异性标记是能够在大多数或全部籼／粳亚种间表现出两亚种基因型差异的标记，而出现这一现象的原因很可能是在这些籼／粳特异性标记位点处存在籼／粳特异性基因。籼粳特异性SSR标记多态性来源于籼粳基因组序列多态性，其变异来源于SSR基序的基因组间不对称交换，在籼粳稻基因组序列上表现为简单重复序列基序重复数的不同。籼粳特异性RFLP标记转化得到的籼粳特异性PCR标记在基因组序列多态性上表现为序列的缺失与插入，所有这些籼粳基因组序列的差异表现在形态、理化性质上的籼粳差异。水稻籼粳特有基因鉴定、基因型与性状的特异性组合将为水稻的分子育种奠定基础。

水稻的耐储藏特性与籼粳基因型之间存在着极显著相关性，可能意味着水稻籼粳分化与耐储藏特性之间有着相似或相近的遗传背景。已有大量研究表明，水稻的耐储藏性与水稻的亚种具有一致性，本研究利用籼粳基因型标记鉴定水稻的籼粳性来鉴定水稻的耐储藏性取得了较为一致的研究结果，因此在选育耐储藏品种时，除可利用籼粳特异性标记鉴定水稻品种的耐储藏特性外，还可以利用籼粳特异性标记的筛选进一步开发耐储藏基因资源，为耐储藏基因鉴定奠定基础。

4 结论

12个籼粳特异性PCR标记可以很好的将水稻品种进行分类，籼粳特异性与水稻的耐储藏性间存在极大的相关性，利用籼粳特异性标记能很好的诊断水稻的耐储藏性能，结合籼粳形态指数鉴定水稻的耐储藏性是一种快捷、简便而有效的手段。籼稻较粳稻耐储藏，其分子机理首先表现在籼粳基因型的不同。

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Relationship Between Storage Stability and Genotype of Rice（Oryza Sativa L.）

Liu Xia1，3，4Du Yarong1Li Xihong1Ma Wen1Wang Wei1Liu Xiangjun1Gao Yumin1Li Lixiu2
（Tianjin University of Science and Technology1，Tianjin 300457）（National Engineering Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products2，Tianjin 300384）（College of Life Science，Nankai University3，Tianjin 300071）（Tianjin Gasin－Donghui Preservation.Technologies Co.，LTD.4，Tianjin 300300）

Technology of storage stability testing，which based on developing ofmolecular markers and PCR technology，would significantly speed up the process of breeding and developing for storage tolerance in rice and other crops.In this study，12 subspecies specificmolecularmarkers based on PCR were used to analyze the genotype of35 rice varieties.And then，the rice of35 varietieswere classified into four groups by clustering analysis of genotype information，including indica，sub－indica，sub－and japonica.Among them，the aging index were all low than 50%in indica and sub－indica varieties，but the storage stability of japonica were almost poor.And sub－japonica varieties'storage stability was good than japonica.And the same time，total acid was rapidly increasing in japonica than indica rice.More important，the diagnosingmethod for storage tolerance was quick，convenient and effective，which would integratemolecular diagnostics and special indica－japonica phenotype characteristic together.Itwas the groundwork for pyramiding breeding of high quality，high yield and storage stability.

rice，subspecies specific，storage，genotype，aging

S379.2

A

1003－0174（2015）11－0001－06

国家自然科学基金（31000826），天津市自然科学基金（12JCZDJC23400），天津科技大学科学研究基金（2012 0108）

2014－04－30

刘霞，女，1976年出生，副研究员，植物生理与分子生物学、粮食陈化机理

李喜宏，男，1960年出生，教授，农产品采后生理及贮藏保鲜技术