CD44v6与胃癌淋巴结转移及预后关系研究

谢建伟，黄昌明，郑朝辉，李 平，王家镔，林建贤

目前，胃癌仍是我国常见的消化道肿瘤之一，每年约有870 000的新发病例[1]。人类CD44基因高度保守，通过选择性剪切和蛋白修饰形成不同亚型[2]。有研究表明，CD44v6介导细胞与细胞外基质之间的粘附，在肿瘤复发、转移方面发挥重要作用[3－4]。本研究通过免疫组织化学检测胃癌组织中CD44v6蛋白的表达，探讨CD44v6与胃癌淋巴结转移及预后的关系，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2006年12月－2008年5月行根治性手术切除的胃癌标本208例，男性154例，女性54例，年龄中位数63.01岁（32～88岁）；高分化腺癌72例，中分化腺癌81例，低分化腺癌55例；行根治性远端胃大部切除100例，根治性近端胃大部切除33例，根治性全胃切除75例。术后按2009年国际抗癌联盟（UICC）公布的胃癌第7版TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例，Ⅲ期136例，Ⅳ期7例。全组共清扫淋巴结6 549枚，中位数为31枚。患者术前均未行放、化疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色采用SP法。广谱二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），鼠抗人CD44v6单克隆抗体（英国Abcam公司）。染色程序按试剂盒说明书进行，主要包括福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片，常规脱蜡至水，抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，滴加一抗、二抗及链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶复合物，DAB显色，对比染色封片。CD44v6的稀释比为1∶2 000，以PBS代替一抗作阴性对照。每例癌组织均有邻近非癌组织作为对照。

1.2.2 结果判定 CD44v6以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析：不着色为0分，浅粉色或黄色为1分，粉色或棕黄色为2分，红色或黄褐色为3分；着色细胞占计数细胞的百分率＜5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，＞50%记3分。由2位资深病理科医师在双盲条件下独立进行结果判定。在低倍镜下（×40）每张切片随机观察10个视野，所得结果取平均数，将染色程度与染色细胞百分率得分相乘，其乘积为最后得分。0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（＋），4～6分为中等阳性（），＞6分为强阳性（）。统计学分析中，（－）和（＋）定为阴性，（）和（）定为阳性。

1.2.3 随访情况 术后随访由专人负责，采用门诊、电话、信件、上门等方式进行，随访频率为患者术后2年内，每3月随访1次，2年后6～12月随访1次。记录的生存时间是自手术时间至末次随访时间或死亡时间或随访数据库截止的时间（2015年5月）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验。用Spearman方法对CD44v6与淋巴结转移的相关性进行分析；用Life－Table法进行生存分析。Kaplan－Meier法制作生存曲线，生存率的比较采用Log－rank法检验。应用COX比例风险回归模型进行多因素分析。

2 结 果

2.1 CD44v6蛋白在胃癌中的表达 CD44v6在胃癌组织中的表达阳性率为59.1%（123／208），在癌旁组织 中 不 表 达 （0／208），差 别 有 统 计 学 意 义（χ2＝174.63，P＝0.000，图1）。

图1 CD44v6在胃癌及癌旁组织中的表达（免疫组织化学染色 ×200）Fig 1 The expression of CD44v6protein in gastric cancer and non－cancerous tissues（IHC ×200）

2.2 CD44v6蛋白表达与患者预后的关系CD44v6蛋白表达阳性与表达阴性患者的中位生存时间分别为58.3和36.2月，术后5年生存率分别为38.8%和76.3%，差别有统计学意义（P＜0.05，图2A）。单因素分析提示，CD44v6高表达、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期与预后密切相关。多因素分析提示，CD44v6高表达和TNM分期为胃癌的独立预后因素（表1，2）。

2.3 胃癌淋巴结转移的相关因素分析 Logistic回归分析显示，肿瘤浸润深度和CD44v6表达与胃癌淋巴结转移的相关性具有统计学意义（P＜0.05），而肿瘤大小及其他临床病理学指标与胃癌淋巴结转移的相关性无统计学意义（P＞0.05，表3）。

2.4 胃癌淋巴结转移和CD44v6表达对预后的影响 全组208例患者中，有淋巴结转移157例，无淋巴结转移51例。有淋巴结转移者和无淋巴结转移的中位生存时间分别为40.2和61.4月，术后5年生存率分别为44.4%和79.5%，差别有统计学意义（P＜0.05，图2B）。有淋巴结转移患者中，CD44v6表达阳性与阴性的5年生存率分别3 0.3%和67.7%（P＜0.05），无淋巴结转移患者中，CD44v6表达阳性与阴性的5年生存率分别77.3%和81.8%（P＞0.05，图2C，2D）。

表1 临床病理资料预后单因素分析Tab 1 The univariate analysis of clinical variables of patients

图2 胃癌淋巴结转移和CD44v6表达对预后的影响Fig 2 The influence on prognosis of patients with lymph node metastasis and CD44v6expression

3 讨 论

CD44基因定位于11p12－13染色体，属于黏附分子家族，可与透明质酸等配体结合，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的粘附，发挥广泛的生物学功能。CD44v6广泛参与肿瘤的发生和发展，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[5－7]。Ryu等认为，CD44v6在胃癌中的表达率为53.3%，其表达水平与胃癌的浸润深度密切相关[8]。Müller等认为，对418例根治性切除胃癌患者预后研究发现，CD44v6并不是预测胃癌患者预后因子[9]。本研究结果显示，CD44v6在胃癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，推测CD44v6可能与胃癌的发生、发展相关。CD44v6表达阳性与胃癌预后不良有关，多因素生存分析表明，CD44v6蛋白表达为胃癌的独立预后因素，这与部分国外学者研究结果一致[10－11]。 提 示 CD44v6 可 能 作为一个影响胃癌浸润行为和预测不良预后的指标。

表2 Cox模型预后多因素分析Tab 2 Multiple stepwise regression analysis with the Cox proportional hazards model

表3 胃癌淋巴结转移相关因素Logistic回归分析Tab 3 Logistic regression analysis of related factors of lymph node metastasis in gastric cancer

淋巴结转移是胃癌最常见的转移方式，淋巴结是否转移是影响胃癌患者预后的重要因素之一。Xin等研究早期胃癌和进展期胃癌中CD44v6表达情况发现，CD44v6表达阳性的胃癌淋巴结转移率较高，CD44v6表达阳性患者3年和5年生存率明显降低[12]。Ozmen等认为，CD44参与胃癌淋巴管生成、脉管浸润和淋巴结转移，在转移阳性淋巴结中表达显著高于阴性淋巴结[13]。本研究资料显示，CD44v6和浸润深度是影响胃癌淋巴结转移的危险因素。进一步分层分析发现，在有淋巴结转移患者中，CD44v6表达阳性与阴性的5年生存率差别有统计学意义（30.3%vs67.7%，P＜0.05），而在无淋巴结转移患者中，CD44v6表达阳性与阴性的5年生存率差别无统计学意义（77.3%vs81.8%，P＞0.05）。这提示CD44v6与胃癌的淋巴结转移密切相关，通过促进胃癌的淋巴结转移从而影响胃癌患者预后。

综上所述，肿瘤干细胞表面标记物CD44v6与胃癌淋巴结转移密切相关。因此，进一步深入研究CD44v6功能有助于判断胃癌预后，也可为胃癌靶向治疗提供理论依据。

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