白三叶草黄酮含量及其抑菌活性研究

王 芳，高 瑾，张 艳，李乔仙，梁 倩

(1.西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南省草地动物科学研究院，云南 昆明 650212)

白三叶草黄酮含量及其抑菌活性研究

王 芳1，高 瑾1，张 艳1，李乔仙2，梁 倩1

(1.西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南省草地动物科学研究院，云南 昆明 650212)

测定了白三叶草提取物的石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相的黄酮含量，并以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌5种细菌及可可葡萄座腔菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、多主棒孢霉和尖孢炭疽菌5种真菌为供试菌，采用抑菌圈法和抑制菌丝生长速率法测定了其抑菌活性。结果表明：石油醚相的黄酮含量为12.98mg/g(12.98％)，氯仿相的黄酮含量为13.89mg/g(13.89％)，乙酸乙酯相的黄酮含量为7.4mg/g(7.4％)，水相的黄酮含量为1.5mg/g(1.5％)；石油醚相对5种细菌无明显的抑制作用，氯仿相对普通变形杆菌和铜绿假单胞菌有抑制作用，其最低抑菌浓度(MIC)分别为2mg/mL和8mg/mL；乙酸乙酯相对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和铜绿假单胞菌的有抑制作用，其最低抑菌浓度(MIC)分别为4，4和8mg/mL，仅水相对5种供试菌株有不同程度的抑制作用。氯仿相和乙酸乙酯相对5种真菌均具有抑制作用，氯仿相对5种供试真菌的抑制作用没有明显差异，其EC50分别为3.54、6.42、8.45、3.63和5.90mg/mL；乙酸乙酯相对多主棒孢霉的抑制抑制作用最强，EC50为2.51mg/mL，对尖孢镰刀菌的抑制作用最弱，EC50为165.43mg/mL，石油醚相和水相对5种真菌均无抑制作用。

白三叶草；黄酮含量；抑菌活性

近年来，植物源药剂以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物[1]。它广泛存在于高等植物中[2]，包括黄酮、黄酮醇、异黄酮醇、黄烷酮、异黄酮等[3-4]，许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，在抗菌、抗病毒、抗过敏、抗氧化、抗癌、免疫调节等方面均具有显著效果，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义[5]，它作为弱雌激素，在治疗妇女更年期综合症方面有很好的应用前景。此外，黄酮类化合物不仅是茶及众多中草药如黄芩、银杏、沙棘等的活性成分[6]，还是多种花卉植物的生物活性成分，如连翘、马蹄莲、山楂、杏、榆叶梅、红王子锦带等[7]。

白三叶草Trifolium repens，又名白车轴草、白荷兰翘摇、金花草、螃蟹花，为豆科Leguminosae车轴草属(三叶草属)Trifolium多年生温带型草本植物，常见于路旁、河岸、湿草地等，原产于地中海地区，现广泛分布于温带及亚热带高海拔地区[8-9]。白三叶草全草皆可用药，具有祛痰止咳、镇痉止痛等功效[10]。近年研究发现，三叶草属植物中含有丰富的黄酮和异黄酮类化合物，具有良好的生物活性和药理作用，具有抗肿瘤、消炎杀菌及抗氧化和清除自由基的功能[11]。黄胜阳等对红三叶草的异黄酮成分进行了分离鉴定，孙琳等对白三叶草的化学成分进行了分离鉴定[12-13]，但都未研究其生物活性及其抗菌活性。本试验对三叶草属中的白三叶草的黄酮含量及抗菌活性进行了初步研究，为进一步探讨该植物的科学利用奠定基础。

1 材 料

1.1 植物材料

白三叶草Trifolium repens，又名白车轴草，于2013年5月25日采自云南省昆明市西南林业大学老校区足球场，经西南林业大学林学院杜凡教授鉴定为豆科Leguminosae车轴草属Trifolium白三叶草，干燥白三叶草粉碎备用。

1.2 供试菌种

供试的菌种包括5种细菌和5种植物病原真菌。其中5种供试细菌为：大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、普通变形杆菌Proteus vulgaris、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa；5种供试真菌为：可可葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani、多主棒孢霉Corynespora cassiicola和尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum。

1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g 、氯化钠5g 和琼脂18～20g，蒸馏水定容到1 000mL，pH 值调至7.0～7.2。牛肉膏蛋白胨液体培养基：除不加琼脂外，与牛肉膏蛋白胨固体培养基配制方法相同。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18～20g。

1.4 仪器与试剂

仪器：EYELA旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司，N-1001)、循环水式多用真空泵(巩义市莫峪予华仪器厂，SHZ-D(Ⅲ))、CP224C电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)、紫外可见分光光度计(SHIMADZU CORP，UV-2450)、超净工作台(SW-CT-IFD)、高压灭菌锅(Yamato SN510C)、恒温培养箱(SPX-300B-G型)。

试剂：芦丁(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，按C27H30O16计，供UV法测定，本品含量为92.5％)、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1 标准曲线的制作

参照刘江雏等[14]的方法并修改，称取芦丁标准样品0.005 0g，放入50mL容量瓶中，用80％乙醇溶液定容至50mL(标准样品的浓度为0.10mg/mL)。取芦丁标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于10mL容量瓶中，并加入5％NaNO2溶液1mL，摇匀；静置6min后，再加入10％Al(NO3)3溶液1mL，摇匀；静置6min后，再加入4％NaOH溶液3mL，用80％乙醇定容至刻度，摇匀；静置15min后，在510nm波长下用分光光度计测定各标准溶液吸光度(A)，绘制芦丁的标准曲线，求出吸光度值A与芦丁的标准溶液浓度(C，mg/mL)之间的线性回归方程。

2.2 总黄酮含量测定

称取石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相4部分供试样品，并用80％乙醇溶解在容量瓶中，再分别取出各部分供测样品，加入容量瓶中，分别精密加入5％NaNO2溶液，摇匀；静置6min，加入10％Al(NO3)3溶液，摇匀；静置6min；再加入4％NaOH溶液，用80％乙醇定容，得待测溶液。在510nm波长下，用分光光度计测定待测溶液的吸光度(A)，按照标准曲线及其换算关系计算出三叶草中石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相中黄酮含量。

2.3 抑细菌活性试验[15]

菌种活化：将供试的5株细菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面，37℃过夜培养。

菌悬液制备：在5个装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中各接种一环活化供试菌株，于37℃培养18h，制得初始菌悬液。用无菌生理盐水采用梯度稀释法制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6等6个浓度梯度的菌悬液；选取10-5，10-6两个梯度各取200μL分别涂布平板，于37℃倒置培养18h后计数。根据培养结果，挑选合适浓度的菌悬液作为供试菌悬液。

抑菌圈法：每个培养皿倒入大约20mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，待培养基凝固以后，分别加入5种菌悬液(大肠杆菌：7.2×106CFU/mL，枯草芽孢杆菌：8.7×106CFU/mL，普通变形杆菌：1.2×106CFU/mL，铜绿假单胞菌：5.8×106CFU/mL，金黄色葡萄球菌：2.2×106CFU/mL)各200μL，用无菌玻璃刮涂布均匀。取直径6mm的无菌滤纸片，放入三叶草提取物的水相(0.32g/mL)、乙酸乙酯相(0.24g/mL)、石油醚相(0.24g/mL)和氯仿相(0.28g/mL)溶液中充分浸泡，以相应的有机溶剂作对照，取出后放在含菌平板上，每个浓度平行作2皿，37℃倒置培养18～24h后，分别测量各样品的抑菌圈直径(mm)。

最低抑菌浓度(MIC)法：根据上述试验结果，对具有明显抑菌圈的样品进行MIC值的测定。对三叶草提取物的样品分别进行连续梯度稀释，取稀释后的样品1mL，分别加入到灭菌的19mL培养基中，混匀，制成平板。待培养基凝固以后，分别加入上述5种菌悬液，各200μL，菌悬液的浓度为106CFU/mL，涂布于平板，于 37℃倒置培养18～24h，观察细菌生长情况。以完全无菌生长的浓度作为供试样品溶液的MIC 值，同时以1.0mL相应的有机溶剂代替三叶草提取物溶液与培养基混合作对照。

2.4 抑真菌活性试验

采用菌丝生长速率法[16]。将三叶草提取物配成一定的浓度，取1mL，然后加入到19mL灭菌后冷却至50℃的PDA培养基中，充分摇匀，并以等体积的生理盐水加入到PDA培养基中作对照，然后倒入直径为90mm培养皿内制成平板，备用。待培养基凝固以后，在每个培养基上接入已制备好的供试病原真菌菌饼(直径为6mm)，菌丝面向下，每个处理设3个重复，置28℃下恒温箱培养4d后，用十字交叉法测量菌落的2个直径，取其平均值作为代表菌落的直径，用下式求出抑菌率：

菌落净生长直径(mm)=测量直径-6。

抑菌率(％)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100％

真菌半抑菌浓度(EC50)的测定[17]。将三叶草提取物中抑菌活性较好的样品，用无菌水稀释成2、4、8和16倍等浓度梯度的溶液，按上述方法测定各浓度下的菌落直径，计算抑菌率。将抑制率转换为几率值，浓度转换为对数形式，以浓度对数(X)为横坐标，抑制率的几率值(Y)为纵坐标，作毒力曲线，得毒力方程和EC50值。以EC50作为衡量样品对不同植物病原真菌生长抑制活性大小的指标。

3 结果与分析

3.1 三叶草样品的处理

取干燥三叶草粉碎样品755g，用80％的乙醇提取，在50℃水浴下回流提取3次，每次1h，得浸膏83g。再将浸膏加适量水，用石油醚萃取得浸膏18g，接着用氯仿萃取得浸膏19g，最后用乙酸乙酯萃取得浸膏2g，最后蒸干水相得44g。

3.2 吸光度值与标准溶液浓度的回归方程

吸光度值A与芦丁的标准溶液浓度(C，mg/mL)之间的线性回归方程为A= 9.642 9C-0.008 2(R2=0.999 0)。分析表明，芦丁质量浓度在0.010～0.050mg/mL时与吸光度值具有良好的线性关系(见图1)。

3.3 各萃取部分黄酮含量

按照标准曲线及其换算关系，计算三叶草提取物各部分的黄酮含量，其石油醚相的黄酮含量为12.98mg/g(12.98％)，氯仿相的黄酮含量为13.89mg/g(13.89％)，乙酸乙酯相的黄酮含量为7.4mg/g(7.4％)，水相的黄酮含量为1.5mg/g(1.5％)。从实验结果可以看出，各个萃取部分的黄酮含量差异比较显著，石油醚相和氯仿相的黄酮含量较高。

图1 不同芦丁标准溶液浓度的吸光度Fig.1 Absorbency of Rutin standard solution concentration

3.4 抑细菌活性

经试验，三叶草的石油醚相对5种供试细菌菌株均无作用，而氯仿相、乙酸乙酯相和水相对5种供试细菌菌株均有不同程度的抑制作用(见表1)。由表1可以看出，三叶草的氯仿部分(0.08g/mL)对普通变形杆菌的抑菌圈平均直径为10mm，铜绿假单胞菌的抑菌圈平均直径为7.8mm，以这2种菌为指示菌，氯仿相的最低抑菌浓度(MIC)分别为2mg/mL和8mg/mL；乙酸乙酯部分(0.08g/mL)对枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈平均直径分别为8、6和4mm，以这3种菌为指示菌，乙酸乙酯相的最低抑菌浓度(MIC)分别为4、4和8mg/mL；水溶物部分(1g/mL)对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等5种供菌种具有抑制作用，其抑菌圈的平均直径分别为1.5、5.0、4.0、1.0和1.5mm，以这5种菌为指示菌，三叶草水相的MIC值分别为28、28、28、20 和 32mg/mL。

表1 三叶草提取物的抑细菌作用Table 1 Bacteriostatic action of extracts from Trifolium repens

3.5 抑真菌活性

经试验，在4mg/mL的浓度下，三叶草的石油醚相和水相对5种供试真菌均没有抑制作用，氯仿相和乙酸乙酯相对5种供试真菌均具有不同程度的抑制作用见表2。从表2可以看出，在4mg/mL的浓度下，氯仿相中的活性物质对5种供试真菌的抑菌活性大小顺序为尖孢镰刀菌＞多主棒孢霉＞尖孢炭疽菌＞可可葡萄座腔菌＞腐皮镰刀菌，乙酸乙酯相中的活性物质对5种供试真菌的抑菌活性大小顺序多主棒孢霉＞尖孢炭疽菌＞可可葡萄座腔菌＞腐皮镰刀菌＞尖孢镰刀菌。

表2 三叶草提取物对5种植物病原真菌的抑制作用Table 2 Inhibition effects of extracts from Trifolium repens to 5 types of pathogenic fungi

由表2可知，三叶草的氯仿相和乙酸乙酯相对各供试菌种的抑菌活性各不相同，为了考察氯仿相和乙酸乙酯的抑真菌活性大小，以5种供试真菌为指示菌，进行了毒力测定，结果见表3。氯仿相5种供试真菌的抑制作用没有明显差异；乙酸乙酯相对多主棒孢霉的抑制抑制作用最强，EC50为2.51mg/mL，对尖孢镰刀菌的抑制作用最弱，EC50为165.43mg/mL。此外，从毒力回归曲线可以看出，不同质量浓度的各样品对植物病原菌的抗菌活性和浓度呈正相关性，即三叶草的氯仿相和乙酸乙酯相对植物病原菌的毒力随着浓度的增高而增强。

4 结 论

(1)试验采用80％的乙醇，50℃回流提取了三叶草中的有效成分，计算其石油醚相的黄酮含量为12.98mg/g(12.98％)，氯仿相的黄酮含量为13.89mg/g(13.89％)，乙酸乙酯相的黄酮含量为7.4mg/g(7.4％)，水相的黄酮含量为1.5mg/g(1.5％)。结果说明乙醇溶液能较好地提取三叶草中的黄酮成分，且其黄酮主要集中在较小极性部分。

(2)抑细菌试验采用抑菌圈法和最低抑菌浓度(MIC)法，经测定三叶草的石油醚相对5种供试的细菌菌株均无作用，其氯仿相对供试菌株中的普通变形杆菌和铜绿假单胞菌有抑制作用，乙酸乙酯相对供试菌株中的枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌和铜绿假单胞菌的有抑制作用，仅水相对5种供试菌株有不同程度的抑制作用，说明水相具有潜在的广谱抗细菌特点。

表3 三叶草提取物对植物病原菌菌丝生长抑制的毒力测定结果Table 3 Virulence of extracts from Trifolium repens to different pathogenic fungi

(3)抑真菌试验采用抑制菌丝生长速率法和真菌半抑菌浓度(EC50)测定法，经测定三叶草的石油醚相和水相对5种供试真菌均没有抑制作用，氯仿相对5种供试真菌的抑制作用没有明显差异，其EC50分别为3.54、6.42、8.45、3.63和5.90mg/mL；乙酸乙酯相对多主棒孢霉的抑制抑制作用最强，EC50为2.51mg/mL，对尖孢镰刀菌的抑制作用最弱，EC50为165.43mg/mL。

(4)试验表明，三叶草中的黄酮含量与抑菌性之间没有很好的相关性，氯仿相的黄酮含量最高，对选用的5种细菌菌株中普通变形杆菌和铜绿假单胞菌有抑制作用，对5种真菌的抑菌效果相对较好，且抑制作用没有明显差异；石油醚相的黄酮含量次之，但是对细菌和真菌均没有抑制作用；乙酸乙酯相的黄酮含量少于石油醚相，对供试的3株细菌菌株有抑制作用，对5种真菌均具有不同程度的抑制作用；水相的黄酮含量最低，对5种细菌菌株均具有不同程度的抑制作用，但对5种真菌无抑制作用。说明三叶草的抑菌活性除了与其中的黄酮类物质有关外，还可能与提取物中的其他活性物质有关，据报道从三叶草属植物中分离得到紫苜蓿酚(dicoumarol)、香豆雌酚(coumestrol)等活性物质[10]。我国三叶草植物资源丰富，后续研究将深入开展该植物化学成分研究，并具体分离鉴定其抗菌活性成分，探讨其抑菌作用机理，为该植物资源的合理利用提供理论基础。

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Flavonoids content and anti-microbial activity of extracts from Trifolium repens

WANG Fang1,GAO Jin1,ZHANG Yan1,LI Qiao-xian2,LIANG Qian1
(1.Key Lab.of State Forestry Administration for Biodiversity Conservation in Southwest China,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan,China;2.Yunnan Academy of Grassland and Animal Sciences,Kunming 650212,Yunnan,China)

The extracts(petroleum ether,chloroform,ethyl acetate phase and water phase of flavonoids)contents from leaves of Crotalaria pallid were measured,and by taking fi ve bacteria(Escherichia coli,Bacillus subtilis,Proteus,Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa),and fi ve fungi(Cocoa grape cavity fungus,Fusarium oxysporum,Fusarium solani,Corynespora cassiicola and Colletotrichum acutatum)as the tested materials,the antibacterial activity of extracts was determined with bacteriostatic circle method and inhibited mycelial growth rate method.The fl avonoid contents of petroleum ether extract,chloroform extract,ethyl acetate extract and water extract were 12.98mg/g(12.98％),13.89mg/g(13.89％),7.4mg/g(7.4％),1.5mg/g(1.5％)respectively.The antibacterial activity on Escherichia coli,Bacillus subtilis,Proteus vulgaris,Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were studied by inhibition zone method and the anti-fungal activity on Botryosphaeria rhodina,Fusarium oxysporum,Fusarium solani,Corynespora cassiicola and Colletotrichum acutatum were studied by hypha growth-inhibiting method.There were no obvious inhibition of the petroleum ether extract to the 5 species bacteria.There were different extent of inhibition of the chloroform extract to Proteus vulgaris and Pseudomonas aeruginosa and the minimal inhibitory concentration(MIC)were 2mg/mL and 8mg/mL respectively.There were different extent of inhibition of the ethyl acetate extract to Bacillus subtilis,Proteus vulgaris and Pseudomonas aeruginosa and the minimal inhibitory concentrations(MIC)were 4mg/mL,4mg/mL and 8mg/mL respectively.There was different extent of inhibition for the water extract to the 5 species bacteria.There was no obvious inhibition of the petroleum ether extract and water extract to the 5 species fungi.There were different extent of inhibition of the chloroform extract to the 5 species fungi with the EC50values of 3.54,6.42,8.45,3.63 and 5.90mg/mL respectively.The ethyl acetate extract had the strongest inhibition to Corynespora cassiicola with the EC50values of 2.51mg/mL and the weakest inhibition to Fusarium oxysporum with the EC50value was 165.43mg/mL.

Trifolium repens;fl avonoids content;anti-microbial activity

S789.9

A

1673-923X(2015)03-0043-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.03.009

2014-01-10

国家自然科学基金项目(31360003，31201572)

王 芳，讲师，博士

梁 倩，讲师，博士，E-mail：liangqian533@163.com

王 芳，高 瑾，张 艳，等.白三叶草黄酮含量及其抑菌活性研究[J].中南林业科技大学学报,2015,35(3):43-47.

[本文编校：吴 毅]