恩诺沙星合成抗原免疫对小鼠肝脏转氨酶活性的影响

孙素玲，张 龙，郭 建 (安徽科技学院，安徽凤阳233100)

恩诺沙星是人工合成的喹诺酮类药物的第3代产品，为动物专用抗菌剂。由于它具有广谱、高效、组织穿透力强等优点，而被广泛用于治疗、预防动物疾病和促进动物生长。但是，恩诺沙星在动物体内的残留消除缓慢，残留于食品中的恩诺沙星在高温下不易分解［1］，长期食用会危害人体健康。欧盟(EC)、WHO和我国等都制定了动物性食品中恩诺沙星的最高残留限量(MRL)［2-3］，并加强了对该药在动物性食品中残留的检测和监督。

目前，肉食品中恩诺沙星残留的检测方法有微生物法、色谱分析法和免疫分析法等，其中免疫分析法具有较高的专一性和灵敏度，是一种很有前途的药物残留快速检测方法。恩诺沙星抗体的制备是建立恩诺沙星残留免疫学检测方法的关键性步骤，严重影响恩诺沙星残留免疫分析法的检测效果。目前，关于恩诺沙星合成抗原的制备与鉴定［4］、恩诺沙星抗体的制备报道很多［5-8］，但尚未见到关于恩诺沙星合成抗原免疫对动物机体影响的报道，为此，笔者研究了恩诺沙星合成抗原免疫对小鼠肝脏转氨酶活性的影响，以期为评价恩诺沙星合成抗原免疫对动物机体的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物。成年健康的昆明种小鼠20只，体重20～25 g，清洁级，由安徽科技学院试验动物中心提供，观察饲养1周。

1.1.2 器材。DY89-1型电动玻璃匀浆机，为宁波新芝科器研究所产品;JB-1A搅拌器(雷磁)，为上海梦汉实业有限公司产品;L216G台式高速冷冻离心机，为上海安亭科学仪器厂产品;S53型紫外可见光分光光度计，为上海棱光技术有限公司产品。

1.1.3 主要试剂。卡介苗，购自上海生物制品研究所;谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒和谷草转氨酶(AST)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。恩诺沙星 (含量99.9%)，购自江西快康动物保健品有限公司。福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂由安徽科技学院基础医学试验室自行配制。恩诺沙星抗原由安徽科技学院基础医学实验室自行合成。

1.2 试验方法

1.2.1 动物免疫。20只小鼠随机分为2组，每组10只。试验组，两侧腹部皮下分点注射含福氏完全佐剂的抗原乳剂2 ml/只，此后每隔2周注射含福氏不完全佐剂抗原乳剂1 ml/只，共免疫4次;对照组，注射同剂量的灭菌生理盐水。试验期间，2组管理条件相同。

1.2.2 检样的采集与处理。最后1次免疫后10 d，停食24 h，不停水。颈椎脱臼处死，剖开腹腔取出肝脏。参照参考文献［9］的方法，制备肝组织匀浆。

1.2.3 肝组织匀浆中蛋白含量的测定(双缩脲法)。参照文献［10］的方法进行标准蛋白曲线的绘制，并得到标准曲线的回归方程。根据样本的吸光度和回归方程，计算出肝组织匀浆中蛋白含量。

1.2.4 AST活性和ALT活性的测定。

1.2.4.1 标准曲线与回归方程。按照试剂盒说明书进行操作，以各管吸光度值减去零管吸光度值的差值为Y轴，以相应的卡门氏单位为X轴，绘制标准曲线，并获得相应回归方程。

1.2.4.2 AST活性和ALT活性的测定。按照试剂盒说明书操作，将测定管吸光度值减去对照管吸光度值之差代入回归方程求出相应的AST/ALT活性卡门氏单位。根据AST/ALT活性卡门氏单位和组织匀浆蛋白质含量，按照以下公式计算出肝脏组织AST/ALT活性:

肝脏组织中AST/ALT活性(U/mg prot)=肝脏组织匀浆AST/ALT活性卡门氏单位/肝脏组织匀浆蛋白含量(mg prot/ml)。

1.2.5 数据统计与分析。使用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计与分析，试验数据以平均值±标准差(±s)表示，采用t检验分析差异显著性，P＜0.05表示差异。

2 结果与分析

2.1 肝组织匀浆中的蛋白含量 根据标准蛋白质溶液的吸光度值，计算出的标准蛋白的回归方程为:

式中，Y为蛋白质含量，X为吸光度。

根据样本的吸光度，根据回归方程计算出蛋白质含量。

2.2 肝组织匀浆中AST活性和ALT活性

2.2.1 标准曲线的回归方程。根据AST标准液的吸光度，得出AST的标准曲线回归方程:

根据ALT标准样品的吸光度，计算出的标准曲线回归方程:

2.2.2 肝组织匀浆中AST和ALT活性。将样本的吸光度值分别代入式(2)和(3)，计算出的样本AST和ALT活性卡门氏单位。然后，再计算出样本 AST活性和ALT活性(表1～2)。

表1 各样本的蛋白含量和AST活性

2.3 恩诺沙星免疫对AST和ALT活性的影响 由表3可知，试验组肝脏组织AST活性略有降低，但与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，因此恩诺沙星免疫小鼠对肝脏组织AST活性没有明显影响。与对照组相比，试验组小鼠肝脏微粒体中ALT活性明显降低，差异极显著(P＜0.01)。

3 讨论

ALT和AST是目前最常用的肝功能检测指标。ALT主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中。AST在心肌细胞中含量最高，其次为肝脏。因此，笔者选择了肝脏组织匀浆作为检样。该试验结果表明，试验组肝脏组织AST活性略有降低，但与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。这说明肝细胞的线粒体仍保持完整，因为肝内的AST有2种同工酶，sAST分布于肝细胞浆内，mAST分布于肝细胞线粒体中，AST只有1/5存在于肝细胞浆中，约有4/5在线粒体。该试验结果表明，与对照组相比，试验组小鼠肝脏微粒体中ALT活性明显降低，差异极显著(P＜0.01)，说明用恩诺沙星合成抗原对小鼠进行4次免疫会损伤肝细胞，因为ALT主要分布在肝细胞浆内，虽然ALT也有可溶性胞浆ALT(s-ALT)和线粒体ALT(m-ALT)2种同工酶，但以s-ALT为主，m-ALT仅占小部分。

表2 各样本的蛋白含量和ALT活性

表3 恩诺沙星合成免疫对肝脏组织转氨酶活性的影响(±s)

表3 恩诺沙星合成免疫对肝脏组织转氨酶活性的影响(±s)

注:＊＊表示与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。

组别 AST活性∥U/mg prot ALT活性∥U/mg prot对照组384.34 ±74.06 934.92 ±117.94试验组 358.04 ±48.63 523.78 ±94.64＊＊

该试验中对照组AST/ALT的比值为0.41，试验组AST/ALT的比值为0.68，试验组AST/ALT的比值有所提高，但都低于1，也说明用恩诺沙星合成抗原对小鼠进行4次免疫会损伤肝细胞，但肝细胞的线粒体仍保持完整。

4 结论

恩诺沙星合成抗原免疫对小鼠肝脏组织ALT活性有抑制作用，但对AST活性没有明显影响。笔者只测定了肝脏组织匀浆中ALT和AST活性，未进行肝脏组织微观上的病理变化观察，其作用机理还有待进一步研究。

［1］LOLO M，PEDREIRA S，MIRANDA J M，et al.Effect of cooking on enrofloxacin residues in chicken tissue［J］.Food Addit Contam，2006，23(10):988-993.

［2］欧洲议会欧盟理事会.Regulation(EC)No 470/2009 of the European Parliament and of the Council［S］.2009.

［3］农业部公告2002第235号:动物性食品中兽药最高残留限量［S］.2002.

［4］宓晓黎，李利东，黄丽俊，等.恩诺沙星免疫抗原的制备与鉴定［J］.中国动物检疫，2010，27(6):43-45.

［5］刘红，曾振灵，杨桂香，等.恩诺沙星单克隆抗体的制备及其鉴定［J］.中国兽药杂志，2006，40(10):5-8.

［6］刘春娥，林洪，曹立民.渔药恩诺沙星完全抗原合成方法及效果的研究［J］.水产学报，2005，29(4):535-539.

［7］赵银丽，王建华，王自良，等.恩诺沙星单克隆抗体的制备及ciELISA试剂盒的研制［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)2009，37(2):33-39.

［8］赵银丽，王建华，王自良，等.抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制［J］.核农学报，2008，22(6):898-903.

［9］王心如，周宗灿，石年，等.毒理学试验方法与技术［M］.北京:人民卫生出版社，2003:153-154.

［10］陈钧辉，陶力，李俊，等.生物化学试验［M］.北京:科学出版社，2003:197-199.