新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

金春梅，朱慧敏，于龙政，张守发(延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133002)

新孢子虫病(Neosporaosis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于多种哺乳动物细胞内所引起的一种原虫病［1］。犬新孢子虫对怀孕母牛的危害尤为严重，可以引起流产，并且通过垂直传播将虫体垂直传播给新生犊牛，给畜牧业造成严重的经济损失［2］。致密颗粒蛋白是一种新孢子虫排泄－分泌抗原，在刺激机体产生保护性免疫反应中起到重要作用。致密颗粒在虫体感染宿主细胞后的前期大量分泌，是带虫空泡及包囊壁的重要组成成分。其中，NcGRA2是新孢子虫速殖子表达量较大的一种致密颗粒蛋白，可以有效抵御新孢子虫速殖子感染［3］。

目前，国内外还没有找到治疗新孢子虫病的特效药，主要以预防为主，实行管理上的防疫措施只能在一定程度上减少新孢子虫的感染，效果往往不显著，关注较多的还是新孢子虫疫苗的研究［4］。基于此，笔者利用真核表达载体pcDNA3.1(+)可以在哺乳动物细胞中表达外源基因的特性，构建新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒，以期将体外表达的蛋白作为免疫原，为进一步研制新孢子虫核酸疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与载体 含有NcGRA2基因的质粒pGEX-4T1-NcGRA2由实验室自制;真核表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司。

1.2 细胞株与试剂 293细胞和大肠杆菌DH5α感受态细胞，由实验室保存备用。限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、DNA Marker、DNA连接酶、DNA纯化回收试剂盒均为TaKa-Ra公司产品;新孢子虫阳性血清由实验室制备并保存;Alexa 488标记的羊抗鼠IgG抗体购自Molecular Probes公司;脂质体转染试剂盒ViaFect Transfection Reagent为Promega公司产品。

1.3 NcGRA2基因的真核表达载体的构建 pGEX-4T1-NcGRA2质粒DNA与pcDNA3.1质粒DNA分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收纯化，然后用DNA连接酶进行连接。

1.4 重组质的酶切鉴定与序列测定 经蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取质粒进行酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的重组质粒送至英捷潍基公司进行序列测定。

1.5 真核表达质粒转染293细胞 将构建的真核表达质粒和真核表达载体pcDNA3.1按照脂质体转染试剂盒操作说明书中的操作步骤转染293细胞。

1.6 间接荧光抗体实验检测目的蛋白的体外表达 细胞转染48 h后，用－20℃预冷的甲醇固定10 min，加入一抗(感染新孢子虫鼠血清1∶200倍稀释)，37℃孵育2 h，PBS冲洗3次。加入二抗(Alexa 488标记的羊抗鼠IgG抗体1∶4 000倍稀释)，37℃下孵育1 h，PBS洗涤3次，置于荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 pGEX-4T1-NcGRA2质粒的酶切结果 pGEX-4T1-NcGRA2质粒DNA经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切得到2个片段，其中较小的1段在636 bp处(图1)，这与预期结果相符合。

2.2 重组质粒的酶切鉴定 NcGRA2酶切回收后与pcDNA3.1连接，挑了2个克隆株，用HindⅢ酶对重组质粒进行切鉴定，其中1个克隆株是正确的，得到的279 bp的目的条带片断，与预期片断相符。另外1个克隆株酶切片段与预期片段不符，属于错误连接。

2.3 间接免疫荧光试验 鉴定为阳性重组质粒用脂质体法转染至293细胞，经过甲醇固定、一抗和二抗的孵育，在荧光显微镜下，可见在细胞表面出现特异荧光(图3A)，而转染pcDNA3.1空载体的细胞无荧光(图3B)。

3 讨论

新孢子虫病能感染多种动物，对牛只威胁严重，主要引起母牛流产，目前缺乏有效预防新孢子虫病的疫苗。新孢子虫GRA2蛋白具有良好的抗原性［5］。真核表达载体pcDNA3.1包含有CMV高效启动子，是一种外源基因在哺乳动物细胞内高效表达的良好载体，目前被广泛应用于DNA疫苗的构建研究［6］。

笔者将新孢子虫全长GRA2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，通过间接荧光抗体试验验证试验所构建的pcDNA3.1-NcGRA2真核表达载体能在体外培养的真核细胞内表达外源蛋白NcGRA2，可为进一步研究抗新孢子虫病的核酸疫苗提供基础。

［1］DUBERY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.Newly recognize falal protozoan disease of dogs［J］.J Am Vet Med Assoc，1988，192(9):1269-1285.

［2］丁德，于龙政，张守发，等.吉林省部分地区黄牛新孢子虫病的流行病学调查［J］.畜牧与兽医，2006，38(11):34-36.

［3］刘群.新孢子虫病［M］.北京:中国农业大学出版社，2012:85.

［4］张宁，赵博伟，胡晓悦，等.牛新孢子虫病最新研究进展［J］.上海畜牧兽医通讯，2012，13(1):10-13.

［5］STROHBUSCH M，MÜLLER N，HEMPHILL A，et al.NcGRA2 as a molecular target to assess the parasiticidal activity of toltrazuril against Neospora caninum［J］.Parasitology，2008，135:1065-1073.

［6］茆达干，杨利国，曹少先.影响基因疫苗免疫效果的因素［J］.中国免疫学杂志，2004，20(5):360-366.