七氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤近期和远期的影响

丛海涛，王惠琴，陈 斌，丁进峰，陈玲阳

七氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤近期和远期的影响

丛海涛，王惠琴，陈 斌，丁进峰，陈玲阳

目的：观察七氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤近期和远期的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠40只，随机分为七氟烷预处理组（A组）和对照组（B组）各20只；七氟烷预处理组在缺血前吸入2%七氟烷30 min，利用大鼠大脑中动脉线栓阻闭法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，阻断血流60 min后，去除线实现再灌注；1个月后进行动物恢复及神经认知行为学评估，包括旷场实验和水迷宫行为学检测。结果：缺血再灌注后，神经功能缺陷评分A组1分、2分、3分分别为4例、10例、6例，B组1分、2分、3分分别为0例，6例，14例，两组差异有统计学意义（P＜0.05）；A组缺血前血糖值为(5.84±0.35)mmol/L,缺血后上升为(8.94±0.46)mmol/L（P＜0.05）；B组缺血前血糖值为(5.76±0.42)mmol/L,缺血后上升为(12.9±0.69)mmol/L（P＜0.05）；两组间缺血后血糖值差异有统计学意义（P＜0.05）；A组旷场实验得分、中央格停留次数以及穿越平台次数分别为(34.83±0.25)分、(2.27±0.19)次和(4.67±0.34)次。B组组旷场实验得分、中央格停留次数以及穿越平台次数分别为(18.83±0.14)分、(1.35±0.11)次和(1.3±0.11)次，两组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：七氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤近期和远期均衡有一定保护作用。

七氟烷；脑缺血再灌注损伤；大鼠；认知功能

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠40只，清洁级，体质量(290±28)g，由温州医科大学动物中心提供。以标准饲料喂养，为1级合格动物。随机分为七氟烷预处理组（A组）和对照组（B组）各20只。七氟烷预处理组在缺血前吸入2%七氟烷。旷场实验仪器和Morris水迷宫实验器材由成都仪器厂提供。

1.2 实验方法 利用大鼠大脑中动脉线栓阻闭法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔内注射，取仰卧位固定。行股动脉穿刺置管持续监测动脉血压及行血液采样。颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。结扎颈总动脉，在颈总动脉上段靠近颈外动脉和颈内动脉分叉处剪一切口。将备好的直径为0.24 mm的栓线缓慢送入切口中，经分叉处穿过颈内动脉。当有轻微阻力时停止，插入深度从分叉处计算约为17～18 mm。固定好栓线，缝合切口。阻断血流60 min，拔出栓线实现再灌注。手术过程中保持自主呼吸，白炽灯照射。体温由肛温探头连接多功能监测仪监测，维持直肠温度在36.5～37.5℃。麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食。

将七氟烷组动物放入处理箱内,经输入孔通以氧气及七氟烷，另一监测孔连接麻醉气体分析仪，持续监测箱内气体浓度。氧流量为4 L/min,调节七氟烷浓度以维持箱内七氟烷吸入浓度为2%。箱内设置有CO2吸收装置。在局灶性脑缺血前持续吸入七氟烷30 min。1个月后进行动物恢复及神经认知行为学评估。⑴旷场实验：旷场实验箱为80 cm× 80 cm×80 cm的正方体无盖箱子，上方用日光灯照明。实验前先在箱内预适应40 min，采用追踪分析系统通过红外装置记录并分析旷场实验得分以及大鼠的水平穿格次数。⑵Morris水迷宫：将大鼠从4个入水点下水进行定位航行实验，训练找到平台，培训8次。定位航行实验完成后撤去平台，大鼠从任一入水点下水，记录在1 min内跨越原平台的次数。

1.3 监测指标 记录缺血前和再灌注24 h后的大鼠体重，再灌注24 h时后神经功能缺陷评分，吸入七氟烷前后的血气分析值，缺血前及缺血后血糖值，进行认知行为学检测，包括旷场实验得分、穿格次数和水迷宫跨越原平台的次数。

神经功能缺陷评分：0分无神经功能障碍；1分不能完全伸展左前肢；2分行走时向左侧转圈；3分行走时向左侧跌倒；4分完全不能行走，意识丧失。累计1分以上即为建模成功。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血前和再灌注24 h后体质量的变化 两组缺血前和再灌注24 h后体质量，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 缺血再灌注24 h后神经功能缺陷评分 缺血再灌注后，两组神经功能缺陷评分均大于1分。与B组比较，A组神经功能缺陷评分差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 两组缺血前和再灌注24 h后体质量的比较（g，±s）

表1 两组缺血前和再灌注24 h后体质量的比较（g，±s）

组别A组B组n 20 20缺血前279±16 283±17再灌注24 h 261±15 263±18

表2 两组再灌注24 h后神经功能缺陷评分的比较

2.3 缺血前后血气变化 两组间pH、PO2和PCO2比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 吸入七氟醚预处理缺血前后血气变化情况（±s）

表3 吸入七氟醚预处理缺血前后血气变化情况（±s）

组别A组B组n 20 20 pH前7.39±0.05 7.40±0.06 pH后7.40±0.06 7.41±0.05 PO2前90.35±7.81 89.32±6.49 PO2后89.86±6.54 88.75±7.12 PCO2前36.86±3.74 37.63±3.57 PCO2后37.89±4.23 36.84±3.97

2.4 缺血后的血糖值 两组缺血后血糖均上升（P＜0.05）。与A组比较，B组缺血后血糖差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组缺血前后的血糖值（±s）

表4 两组缺血前后的血糖值（±s）

注：与A组比较，aP＜0.05

组别A组B组n 20 20缺血前5.84±0.35 5.76±0.42缺血后8.94±0.46 12.9±0.69a

2.5 旷场实验 两组间旷场实验得分、中央格停留时间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 旷场实验得分和中央格停留时间比较（±s）

表5 旷场实验得分和中央格停留时间比较（±s）

注：与A组比较，aP＜0.05

组别A组B组n 20 20旷场实验得分（分）34.83±0.25 18.83±0.14a中央格停留时间(min) 2.27±0.19 1.35±0.11a

2.6 水迷宫结果 A组大鼠穿越平台次数为（4.67± 0.34）次，B组（1.3±0.11）次（P＜0.05）。

3 讨论

本研究采用目前常用的大鼠大脑中动脉线栓法制备脑缺血再灌注损伤模型，结果显示，两组大鼠缺血再灌注后体重均减轻，且两组大鼠大脑中动脉线栓后神经功能缺陷评分增加。说明大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型制备成功。A组神经功能缺陷评分比B组低，提示七氟烷预处理可减轻大鼠局灶性脑脑缺血再灌注损伤。血气结果表明，吸入七氟烷后并未导致动物明显的缺氧和二氧化碳潴留以及酸中毒。由此可排除吸入七氟烷抑制呼吸引起的低氧诱导的脑保护作用。

血糖被认为是加重脑脑缺血再灌注损伤的因素之一，高血糖可加重脑组织缺血性损伤。关于其机制的阐述，Rizk等[2]认为，脑缺血缺氧时葡萄糖无氧酵解加重，其终产物乳酸盐生成增多，而高血糖增加了底物供给，更使乳酸盐大量堆积，致脑组织局部酸中毒，破坏血－脑屏障，加剧脑水肿及神经细胞死亡，使梗死面积扩大。B组血糖明显高于A组，表明七氟烷可减轻大鼠局灶性脑脑缺血再灌注损伤，对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

本研究证实，在动物脑缺血损伤前给予七氟烷吸入，可以对缺血后脑有保护作用，减轻动物的脑缺血损伤。我们考虑2%七氟烷为临床麻醉常用浓度，选择七氟烷浓度为2%。更高浓度的吸入七氟烷虽有可能进一步增强其脑保护效果，但随之带来的呼吸抑制等不良反应也可能相应增加。

行为学检测是极为重要的对大鼠远期认知功能的影响观察指标，旷场实验是一种评价实验动物在新异环境中自发行为、探索行为的方法。本研究结果显示，七氟烷组和对照组间的旷场实验得分、中央格停留时间的差异均有统计学意义，提示与缺血对照组比较七氟烷预处理能提高大鼠的自主探索能力。Morris水迷宫所检测的是大鼠空间辨别学习记忆的能力，与海马结构功能密切相关。穿越平台次数是最为重要的指标之一，穿越平台的次数越多，说明学习记忆能力越强[3]。本研究结果显示，两组大鼠穿平台次数的差异有统计学意义，说明与脑缺血再灌注组比较七氟烷预处理对脑缺血的大鼠远期的空间和位置学习记忆有明显提高。

有关吸入麻醉药的脑保护作用机制,目前认为与吸入麻醉药能激活神经元突触后GABAA受体,延长并增强GABAA受体对氯离子的传导,产生长时间通道开放状态,抑制突触兴奋性,减少钙离子内流,从而降低突触后神经元内的钙离子浓度有关[4]。Toner等[5]通过皮层脑片缺氧缺糖模型研究发现,七氟烷预处理可以降低脑片孵育上清液中谷氨酸的浓度。Kristin等[6]通过微透析方法研究也发现,七氟烷预处理可以降低脑缺血大鼠脑内谷氨酸浓度。2.5%和4%七氟烷能分别降低离体脑额叶皮层神经元细胞突触前膜去极化引起的谷氨酸释放，其抑制程度分别达到45%和55%。Do等[7]研究发现，七氟烷能通过直接作用于PKC激酶的催化区和调节区，激活PKC激酶，后者的激活能增强突触前膜神经元型谷氨酸转运体的转运功能，从而降低中枢兴奋性递质的浓度。因此，降低脑内兴奋性递质谷氨酸浓度，减弱其引起的兴奋性损伤，可能是七氟烷脑保护作用的关键。也有实验表明七氟醚可能是通过Caspase激活[8-9]、氧化应激反应[10-11]、细胞内钙离子稳态失衡[11-12]等途径引发神经细胞凋亡，诱导BACE-1上调增加Aβ表达，从而影响老年大鼠的认知功能。本研究证实选用的脑缺血成年大鼠经过七氟烷预处理，在一定程度上可以减轻认知功能损害。

七氟烷是一种既适合全麻诱导又适合全麻维持的吸入麻醉药。动物实验表明，七氟烷预处理在脑缺血-再灌注损伤中具有保护作用[13]。赵平等[14]认为，1.5%和2%异氟烷后处理能够减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤程度。临床常用的异氟烷吸入浓度对新生大鼠具有脑保护作用，这为异氟烷后处理在生后窒息的新生儿的应用奠定了基础。吴周全等[15]认为，七氟烷预处理在一定程度上减轻CPB后引起的脑损伤及潜在的认知功能损害，可能与其降低ET-1的含量、增加CPB脑血流灌注有关。

临床上进行颈动脉内膜剥脱术和冠状动脉旁路移植术等的病人都具有潜在脑缺血的可能，麻醉时选择有脑保护作用的麻醉药物具有重要意义。本研究为临床麻醉医师处理脑缺血或潜在脑缺血的病人时麻醉药物的选择，提供了一定的实验依据。同时七氟烷预处理的脑保护作用预处理治疗脑损伤临床意义可能适用于难产引起的新生儿脑缺氧-缺血、新生儿心脏手术、脑室内出血的新生儿等疾病的治疗。

[1]徐仲煌，黄宇光，张秀华，等．异丙酚-阿芬太尼静脉麻醉和七氟醚-氧化亚氮吸入麻醉对脑血管CO2反应性的影响[J].中华麻醉学杂志，2000，20(7):406-408．

[2]Rizk NN,Rafols J,Dunbar JC.Cerebaral ischemia-induced apoptosis and necrosis innormal and diabetic rats[J].Brain Res,2005,1053 (1-2):1-9.

[3]Callaway JK,Jones NC,Royses AG,et al.Sevoflurane anesthesia does not impair acquisition learning or memory in the morris water mazein young adult and aged rats[J].Anesthesiology,2012,117 (5):1091-1101.

[4]Wamer DS.Isoflurane neuop rotect ion:a passing fan tasy,again [J].Anesthesiology,2002,92(5):1226-1228.

[5]Toner CC,Connel ly K,Whelpton R,et al.Effects of sevof lurane on dopamine,glutamate and aspartate release in vitro model of ce⁃rebralischaemia[J].Br J Anesth,2001,86(5):550-554.

[6]Kristin E,Christian W,William EH,et al.The effect of sevoflu⁃rane and propofol on cerebral neurotransmitter concen trations dur⁃ing cerebrain ischemia in rat[J].Anesth Analg,2003,97（6）: 1155-1161.

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[14]赵平，柴军，龙波，等.异氟醚后处理对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用[J].中国医科大学学报，2012，41（1）:5-7.

[15]吴周全，崔苏扬，李立，等.七氟醚预处理对心肺转流后患者脑损伤的影响[J].临床麻醉学杂志，2013,29(5)：439-442.

（收稿：2014-09-20 修回：2015-01-26）

（责任编辑 李文硕）

Short-term and Long-term Effects of Selflurane Preconditioning on Cerebral Ischemia Reperfusion In⁃jury in Rats

CONG Hai-tao,WANG Hui-qin,CHEN Bin,et al.
Department of Anesthesiology,Taizhou Hos⁃pital of ZheJiang Province,Linhai(317000),China

ObjectiveTo observe the short-term and long-term effects of selflurane preconditioning on ce⁃rebral ischemia reperfusion injury in rats.MethodsForty healthy adult male SD rats were divided randomly into group A(sevoflurane preconditioning group)and group B(control group).There were 20 rats in eachgroup.2%sevoflurane was inhalated 30 min before ischemia in sevoflurane preconditioning group.The rat model of middle cerebral artery occlusion was established.The blood flow was blocked 60 min later,the line was pulled out and the brain reperfused.One month later the rats were given the assessment of neural cognitive be⁃havioral recovery,including empty field experiment and water maze behavioral testing.The body weights of rats were recorded before ischemia and after reperfusion 24 h later;The nerve function defect score was recorded af⁃ter reperfusion 24 h later;Blood gas analysis was recorded before and after inhalation sevoflurane.Blood sugar of both groups were recorded before and after ischemia;cognitive behavioral tests were done,including empty field experiment and water maze experiment.ResultsNerve function defect scores of 1,2 and 3 in group A after ischemia reperfusion were 4,10 and 6,while 0,6 and 14 in group B.The difference between group A and group B was statistically significant(P＜0.05).Blood sugar in group A before ischemia was(5.84±0.35)mmol/L, while(8.94±0.46)mmol/L after ischemia（P＜0.05）;Blood sugar in group B before ischemia was(5.76±0.42) mmol/L,while(12.9±0.69)mmol/L after ischemia（P＜0.05）.The difference of blood sugar after ischemia be⁃tween group A and group B was statistically significant(P＜0.05).Empty field experiment scores,the central grid stops and crossing platform numbers were 34.83±0.25,2.27±0.19 and 4.67±0.34 respectively in group A, empty field experiment scores,the central grid stops and crossing platform numbers were 18.83±0.14、1.35±0.11 and 1.3±0.11 respectively in group B.The difference between group A and group B was statistically significant (P＜0.05)； Conclusion Sevoflurane preconditioning on ischemia reperfusion injury in rats has certain protec⁃tive short-term and long-term effects.

Sevoflurane;cerebral ischemia reperfusion injury；rats;cognitive function脑缺血疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一，具有发病率、致残率、死亡率高的特点。脑缺血可以引起一系列病理生理和生化方面的改变,目前公认的脑缺血损伤机制包括兴奋性损害、Ca2+超载、自由基及脂质过氧化、线粒体功能障碍、NO、细胞因子、立早基因和热休克蛋白表达紊乱、细胞凋亡等。七氟烷是新型卤代烃基醚类挥发性吸入麻醉药，临床应用具有苏醒快、刺激小，既能增加脑血流量，又能保留中枢自主调节等特点。有研究表明[1]，七氟烷预处理可增加脑血流量、降低脑代谢率，从而对脑组织起到保护作用。本研究观察了七氟烷预处理对大鼠缺血再灌注损伤的近期和远期影响，并探讨其可能的机制。

Q95-33;R651

A

1007-6948(2015)02-0156-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.02.015

浙江省温州医科大学附属台州医院麻醉科（临海 317000）

丛海涛，E-mail:33363534@qq.com