补肾健脾方对肾病综合征模型大鼠性腺功能及病理结构的影响*1

王　 静　王　娟

(1. 青岛市海慈医疗集团青岛市中医医院儿一科，山东　青岛　266033；2.青岛市海慈医疗集团检验科，山东　青岛　266033 )

补肾健脾方对肾病综合征模型大鼠性腺功能及病理结构的影响*1

王 静1王娟2

(1. 青岛市海慈医疗集团青岛市中医医院儿一科，山东青岛266033；2.青岛市海慈医疗集团检验科，山东青岛266033 )

摘要：目的探讨补肾健脾方对肾病大鼠性激素和性腺功能及病理结构的影响。方法采用盐酸阿霉素大鼠尾静脉注射建立实验性肾病综合征大鼠，分别观察环磷酰胺(CTX)单用及与补肾健脾方联合使用对肾病大鼠性激素的影响，观察肾组织和睾丸切片病理学改变。结果补肾健脾方和CTX联合使用与单独使用CTX相比，二者联合使用可使大鼠的血清睾酮(Ts)含量明显高于CTX致性腺损伤大鼠的Ts含量，同时具有降低卵泡刺激素(FSH)，促黄体生成素(LH)含量，两组比较差异均有统计学意义(p<0.05)，调节性激素水平趋向正常。且二者联合使用组大鼠睾丸组织切片无明显病理学变化。结论补肾健脾方可保护和促进生殖机能，并可能通过促进下丘脑—垂体—性腺轴的组织形态学改变和调节其内分泌、以及清除自由基，发挥对抗或减轻CTX的性腺毒性的作用。

关键词：肾病综合征；补肾健脾中药；环磷酰胺；性腺；大鼠

肾病综合征(Nephrotic Syndrome，NS)是由多种病因和多种病理类型引起肾小球疾病中的一组临床综合征，典型临床表现为大量蛋白尿(每日≥3.0～3.5 g)、低蛋白血症(血浆白蛋白<30 g/l)、高脂血症和水肿。NS是小儿泌尿系常见病，其中难治性肾病综合征(Refractory Nephrotic Syndrome，RNS)约占NS的50%左右，临床治疗颇为棘手。难治性肾病综合征(Refractory Nephrotic Syndrome，RNS)是指对激素抵抗、依赖和经常复发(1年内复发3 次以上或半年内发作超过2 次以上)及不能耐受激素副作用而难以继续用药的肾病综合征[1]。环磷酰胺(Cytoxan，CTX)是治疗小儿RNS最有效的药物之一，由于其对性腺的毒性作用，尤其对男性精原细胞的影响，限制了该药在临床上的广泛应用。我们通过动物实验，旨在研究中药补肾健脾方与CTX合用对大鼠性腺的影响，为今后临床应用CTX治疗肾病时，减轻其对性腺的损害提供一定的用药经验和佐证。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物原交系健康雄性Wistar大鼠40只，6周龄，体质量160～190 g，购于山东大学实验动物中心，SPF级。

1.1.2主要试剂与仪器 血清睾丸酮(Ts)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)放免测定试剂盒，购于天津得普生物科学公司(批号 980811)。DDL-5冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂，速度：4000转，时间：10 min)，GMJ型全自动放射免疫γ计数器(江苏医疗电子研究所)。

1.1.3试验药品 盐酸阿霉素(ADR针剂)10 mg/支(批号 0303E1，深圳万乐药业有限公司)；0.9%生理盐水10 ml/支(批号 030519)；CTX200 mg/支(批号 030404，上海华联制药有限公司)；泼尼松5 mg/片(批号 0304021，山东新华制药股份有限公司)；4%异戊巴比妥钠(批号 860122，union进口分装，上海化学试剂采购供应站分装厂)；中药补肾健脾方水煎液(成分：黄芪12 g，淫羊藿10 g，白术12 g，巴戟天10 g，肉苁蓉10 g，菟丝子10 g，当归12 g，枸杞子15 g，陈皮10 g，五味子6 g)经煎煮、过滤，制成100%水煎剂，1 ml药液约含1 g生药。以上药品均购于山东中医药大学附属医院。

1.2方法

1.2.1实验分组40只Wistar雄性大白鼠随机分为4组，即空白对照组、模型对照组、CTX组、CTX+中药组，每组10只。

1.2.2实验造模 除空白对照组外，余3组建立NS动物模型。大鼠非麻醉下以ADR 6.2mg/kg量，尾静脉一次注射性造模(临用时ADR用注射用水配成2 mg/ml的溶液)[2]。空白对照组注射等量的生理盐水。注射后将大鼠饲养于代谢笼中，自由摄食饮水，并于注射后第7、8、9天开始记录尿蛋白定性情况，当尿蛋白定性≥ +++，并持续3 d以上者，即为模型制作成功。四组动物共死亡5只，其中CTX组1只因尾部严重感染于治疗后第5天死亡；CTX+中药组因灌胃不当，窒息死亡2只；模型对照组因未做治疗，于造模成功后第4天尾部严重感染死亡1只，第15天不明原因死亡1只，考虑可能与ADR和CTX均有较强的细胞毒性有关。

1.2.3实验方法造模成功后，4组均正常饮食。CTX组和CTX+中药组腹腔注射CTX，每次20 mg/kg，隔日1次，一周3次，共12次。其总量相当于临床患儿的用药总量，平均每天用量(10 mg/kg)相当于临床用量(2～3 mg/kg·d)的3～5倍。CTX+中药组除CTX用法同上外，再予中药补肾健脾方煎剂每日灌胃10ml/kg。两组均每日灌服泼尼松5 mg/kg，晨起顿服，每天1次，连续4周。(CTX组和CTX+中药组均需每周称重以随时调整用药剂量)，给药剂量按《中医科研设计与统计方法》提供的常用动物与人的不同体质量的药物换算公式计算。(公式：D1：D2=R1：R2，D2=D1×D2÷R1? D2为所求剂量，D1为已知剂量，R1为相应已知值，R2为与待求剂量D2相应动物体表面积换算比值)。实验期间每周记录一次动物的一般情况，并于造模前、造模后1周和用药4周后单个地置于代谢笼，禁食1天，收集24 h尿液，检测24 h尿蛋白定量。于用药4周后全部动物先用4%异戊巴比妥钠按4 mg/kg麻醉，行腹主动脉取血，大约5 ml。送往实验室检测血生化和性激素。Ts、FSH、LH，用放射免疫方法测定含量，由山东中医药大学附属医院核医学室协助测定。取大鼠肾组织与睾丸，测定其重量，冷冻制病理切片镜下观察。

1.2.4实验观察一般情况(大鼠饮食、体质量、尿量、水肿状况、毛泽、活动性、存活率等)，用药前后大鼠体质量的变化，用药前后大鼠24 h尿蛋白定量的变化，用药前后各组大鼠血生化比较，用药前后各组大鼠Ts、FSH、LH含量比较，用药前后各组大鼠性腺重量变化，以及用药前后各组大鼠肾脏与睾丸光镜下的病理学变化。

2结果

2.1一般观察模型组食量明显减少，尿量减少，并出现明显浮肿，精神萎靡，倦怠少动，消瘦，皮毛无光泽，并有竖毛、脱毛现象。两个治疗组的动物在用药后，上述表现明显改善，尤以CTX+中药组改善明显。

2.2各组大鼠体质量变化比较见表1。

表1　各组大鼠体质量变化比较(g，±s)

表1　各组大鼠体质量变化比较(g，±s)

空白对照组模型对照组CTX组CTX+中药组n10898造摸前175.91±7.63183.82±1.63176.92±4.65179.84±9.33用药4周后230.56±4.39*160.13±3.49199.29±6.65*229.77±2.81**

与模型对照组比较*P﹤0.05，与CTX组比较**P﹤0.05。

表1显示 实验前各组大鼠体重无明显差异(P﹥0.05)。用药4周后CTX+中药组和CTX组大鼠体重明显高于模型对照组，有显著性差异(P﹤0.05)，CTX+中药组大鼠体重高于CTX组，有显著性差异(P﹤0.05)。

2.3用药前后大鼠24 h 尿蛋白定量的变化见表2。

表2　用药前后大鼠24 h 尿蛋白定量的变化(mg/24h，±s)

表2　用药前后大鼠24 h 尿蛋白定量的变化(mg/24h，±s)

空白对照组模型对照组CTX组CTX+中药组n10989造模前8.17±1.937.69±1.388.37±2.637.91±1.95造模后第1周7.91±0.48184.06±5.35*186.43±4.80*179.59±4.87*用药4周后8.04±0.50*191.76±7.6059.39±10.11*33.25±6.73**

与模型对照组比较*P﹤0.05，与CTX组比较**P﹤0.05。

表2显示造模前各组大鼠尿蛋白无明显差异(P﹥0.05)。造模后1周，除空白对照组外，余三组尿蛋白均升高，且与空白对照组比较有显著性差异(P﹤0.05)，组间无差别(P﹥0.05)。用药4周后，CTX组和CTX+中药组尿蛋白都有所降低，与模型对照组相比均有显著差异(P﹤0.05)，CTX+中药组尿蛋白水平低于CTX组，有显著性差异(P﹤0.05)。

2.4用药4周后大鼠血生化比较见表3。

表3　用药4周后大鼠血生化比较 (±s)

表3　用药4周后大鼠血生化比较 (±s)

空白对照组模型对照组CTX组CTX+中药组n10898Tp(g/l)64.47±6.87*47.08±5.0755.73±6.81*62.33±3.09**Alb(g/l)28.60±3.80*20.32±3.4723.97±2.15*27.55±3.42**Ch(mmol/l)3.83±0.32*6.56±0.335.04±0.55*3.81±0.40**TG(mmol/l)1.13±0.17*2.31±0.171.70±0.06*1.25±0.13**BUN(mmol/l)5.93±0.505.81±0.906.23±1.305.61±0.60Cr(mmol/l)61.7±4.9063.1±5.6066.9±4.3063.4±2.70

与模型对照组比较*P﹤0.05，与CTX组比较**P﹤0.05

表3显示 用药4周后，CTX组、CTX+中药组与模型对照组相比总蛋白(Tp)、白蛋白(Alb)有显著升高(P﹤0.05)，胆固醇(Ch)、甘油三酯(TG)有显著降低(P﹤0.05)，且两组间有比较均有显著差异(P﹤0.05)。尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)：各组间无明显差别(P﹥0.05)。

2.5用药4周后大鼠性激素定量的变化见表4。

表4　用药4周后大鼠性激素定量的变化　(±S)

表4　用药4周后大鼠性激素定量的变化　(±S)

组别空白对照组模型对照组CTX组CTX+中药组n10898Ts(ng/24h)1.98±0.062.11±0.301.04±0.32*1.78±0.14**LH(IU/24h)5.23±0.654.90±0.747.86±0.64*5.69±0.29**FSH(IU/24h)3.98±0.623.94±0.577.01±1.00*4.66±0.59**

与模型对照组比较*P﹤0.05，与CTX组比较**P﹤0.05

表4显示用药4周后，CTX组、CTX+中药组与模型对照组相比Ts有显著降低，LH 、FSH 有显著升高(P﹤0.05)。并且，CTX+中药组与CTX组相比Ts含量有明显升高，LH 、FSH 有显著降低，均有显著性差异(P﹤0.05)。

2.6用药4周后各组大鼠性腺重量比较见表5

表5　用药4周后各组大鼠性腺重量比较(g，±s)

表5　用药4周后各组大鼠性腺重量比较(g，±s)

组别空白对照组模型对照组CTX组CTX+中药组n10898睾丸重量0.219±0.040.217±0.0390.219±0.0530.265±0.043

与模型对照组比较*P﹤0.05，与CTX组比较**P﹤0.05

表5显示：用药4周后，CTX+中药组睾丸重量比CTX组有明显升高，有显著性差异(*P﹤0.05)，与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)。CTX组与空白对照组相比睾丸重量无明显差异(P﹥0.05)。

2.7肾组织病理学观察

光镜下HE染色观察肾标本，空白对照组大鼠肾小球轮廓清楚，无任何异常。模型对照组大鼠肾小球轮廓大致清楚，未见明显改变，但多个肾小管内可见蛋白管型，肾间质充血明显。CTX组肾小球基本正常，肾小管内有蛋白管型，肾间质充血不明显。CTX+中药组肾小球未见异常，肾小管内偶见管型，肾间质改变不明显。

2.8睾丸切片病理学观察

高倍镜下，空白对照组大鼠睾丸曲细精管内可见各级生精细胞及支持细胞，精原细胞及各级精母细胞结构清楚，可见大量精子，见图1。模型对照组组大鼠睾丸未见明显改变，基本同正常组，见图2。CTX组大鼠睾丸的曲细精管生精上皮细胞排列紊乱，各级生精细胞明显减少，精子细胞及精子不易见到，见图3。CTX+中药组大鼠睾丸损伤较轻，曲细精管内可见各级生精细胞，结构清楚，精子细胞及精子较正常组略减少，见图4。

图1　空白对照组大鼠睾丸病理切片(HE×100)

图2　模型对照组大鼠睾丸病理切片(HE×100)

图3　CTX组大鼠睾丸病理切片(HE×100)

图4　CTX+中药组大鼠睾丸病理切片(HE×100)

3讨论

“肾病综合征”在祖国传统医学中并无此病名记载，但从其临床表现上来看，它散在的记载于“水肿”、“精微下漏”、“癃闭”、“关格”、“虚损”等病证中。小儿肾病综合征的根本病机为“脾肾亏虚”，临床多见脾虚湿困，肾阳虚损，病性属虚中夹实，补肾健脾方切合病机，以扶正为主，祛邪为辅，治以补气健脾，温肾壮阳，补血固精，利水消肿。使阴阳互补，气血相生，补泻并施，散敛兼顾。

本实验研究表明，中药补肾健脾方可明显提升大鼠体重，升高血清Tp和Alb，降低Ch和TG含量，降低大鼠蛋白尿，从而改善“肾病综合征”的临床表现；此外，补肾健脾方和CTX联合使用与单独使用CTX相比，含补肾健脾方组大鼠的Ts含量明显高于CTX组，且有统计学意义(P﹤0.05)，同时具有降低FSH、LH含量，而且含补肾健脾方组的睾丸重量明显高于其他各组，说明补肾健脾方可明显改善雄性大鼠性腺功能。 CTX+中药组与CTX组的Ts、FSH、LH相比较，差异均有统计学意义(P﹤0.05)。说明补肾健脾方和CTX联用可以调节性激素水平趋向正常的作用。且CTX+中药组大鼠睾丸较CTX组在光镜下病理切片损伤较轻，说明中药补肾健脾方具有保护睾丸组织结构，维护结构稳定性的作用。

结合有关资料分析认为[3][4]，补肾健脾方可以保护和促进生殖机能，并可能通过促进对下丘脑—垂体—性腺轴的组织形态学改变和调节其内分泌，以及抗氧化、清除自由基的作用来发挥对抗或减弱CTX造成的性腺损害。因此，通过调节Ts、FSH、LH的平衡而防治CTX所致的性腺损害，可以被认为是中药补肾健脾方的作用机理之一，为临床应用提供了一定的依据。但由于各方原因我们的研究还不够深入，还不能从分子及基因角度来阐述补肾健脾方改善肾病综合征临床症状的机制，以及保护性腺功能及维持睾丸组织结构的稳定性具体原理，这将是我们下一步的研究目标。

参考文献：

[1]陈江华,李夏玉.难治性肾病综合征免疫抑制治疗的临床挑战.现代实用医学,2012,24(5):483~485.

[2]单次尾静脉注射法阿霉素大鼠肾病模型的建立.中国实验动物学报,2013,21(1):4.

[3]补肾健脾法对卵巢功能围早衰患者卵巢储备功能影响的临床研究,中国临床研究,2013,26(1):73-74.

[4]补肾健脾方对下丘脑-垂体-卵巢轴功能的影响,中医研究,2010,23(1):28-29.

王静，女，医学硕士，主治医师，研究方向：中医儿科。

作者简介：王静(1977—)，女，山东青岛人，主治医师，硕士，主要从事临床中医儿科工作。

中图分类号：R692

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2015)04-0384-04

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.008

(收稿日期2015-1-10)

Effects of spleen-kidney reinforcing formula on the sexual glands and related pathological structures of experimental rats with nephrotic syndrome

WANGjingWANGJuan

(Hai Ci Medical Group of Qingdao,Qingdao 266033，China)

Abstract：Objective: To explore the effective mechanism of kidney-spleen reinforcing formula (Bu Shen Jian Pi Fang) on the sexual glands and hormones as well as related pathological structures of rats with nephrotic syndrome. Methods: Experimental rats with nephrotic syndrome were created by tail vein injection of Doxorubicin hydrochloride. The effects on the sexual hormones of these rats exerted by single application of Cyclophosphamide (CTX) and combined application of CTX and kidney-spleen reinforcing formula were observed respectively. Pathological changes of the kidney tissue slice and testicle slice were observed. Results: Compared to the group treated by using CTX alone, the group treated by the combined therapy had obviously higher level of serum testosterone (Ts). In addition, the combined therapy was able to bring down follicle-stimulating hormone (FSH) and LH. The two groups had significant differences (P<0.05) in all the above indexes. Both of the two groups were able to regulate the sexual hormone level to normal and there was no significant pathological change of the testicle tissue slice. Conclusions: Kidney-spleen reinforcing formula can protect and promote the reproductive function and relieve or counteract the CTX toxicity on sexual glands by regulating endocrines and obliterating free radicals possibly through the histomorphological changes of hypothalamus-pituitary-gonad axis.

Key words：nephrotic syndrome； kidney-spleen reinforcing formula； CTX； sexual gland；rats