抑制青霉菌乳酸菌的分离、鉴定及抑菌物质分析

李 院，魏新元，王 静，丁 武，郑方圆，胡先苗，寇莉萍

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

抑制青霉菌乳酸菌的分离、鉴定及抑菌物质分析

李 院，魏新元*，王 静，丁 武，郑方圆，胡先苗，寇莉萍*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

目的：从市售酱菜中筛选具有抑制青霉菌活性的乳酸菌，测定其对酱菜中主要霉菌及产毒真菌的抑菌效果，分析乳酸菌抑制青霉菌的有效成分，并对乳酸菌进行分子生物学鉴定。方法：采用双层平板法对酱菜中具有抑制青霉菌活性的乳酸菌进行筛选，打孔法测定其抑制青霉菌作用，并采用蛋白酶消化、调节pH值、热处理等方法分析抑菌物质的有效成分，采用16S rDNA聚合酶链式反应扩增后测序对乳酸菌进行鉴定。结果：从酱菜中筛选出的14 株乳酸菌中，其中3 株对酱菜中分离的青霉菌及2 株产毒真菌的生长有较明显的抑制作用，不同蛋白酶处理、pH值调节对乳酸菌发酵浓缩液的抑菌活性会有不同影响，但是3 种加热处理并不改变抑菌效果。3 株乳酸菌经鉴定分别为：弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。结论：从酱菜中分离的乳酸菌对酱菜中青霉菌及某些产毒霉菌的生长有明显抑制作用，推测其抑菌成分可能为小分子肽和/或有机酸。

酱菜；乳酸菌；霉菌；抑菌物质；抑制活性

酱菜是中国民间常见的佐饭小菜，拥有悠久的历史，深受广大人民群众的喜爱。酱菜随吃随取，方便实用，配粥，配面食，甚至米饭、零食也皆可配食。通常先将洗净晾干的蔬菜进行腌制后再洗净控干，然后加入酱料并配以香辛料，最后拌油即成酱菜[1]。酱菜水分含量较高，在生产、加工及贮存过程中极易受到各种微生物的污染，从而导致蔬菜变色、变味、腐败变质，有些霉菌还可能产生真菌毒素引起食物中毒[2-3]。现在通常采用盐渍和添加防腐剂延长酱菜保质期，但高盐和防腐剂容易对人体造成伤害。制作低盐化及低防腐剂的酱菜，既保持其固有的品质，又能延长其货架期，是蔬菜腌制品行业发展的新课题和发展趋势。

乳酸菌是当前广泛应用于食品行业中的被普遍认为安全（general regard safety，GRS）的一类微生物。近几年来，乳酸菌对一些腐败菌和致病菌的抑制作用研究引起人们极大的关注，相关抑菌机制也得到阐明[4-9]。目前，多种发酵食品中乳酸菌的抑菌作用已被证实[10-12]，但关于酱菜是否存在乳酸菌及其抑菌作用鲜有报道，因此，本研究拟从酱菜中筛选对其分离出的污染霉菌具有明显抑制作用的乳酸菌，对其抑菌成分进行分析，并对乳酸菌进行分子生物学鉴定，以期为延长低盐及低防腐剂酱菜的保质期提供生物防腐资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与菌种

酱菜制品：包括酱制黄瓜、白萝卜条、海白菜、大蒜、辣椒酱、芥菜丝，共6 种，购于超市和市场，6 种酱菜均为非发酵型酱菜。

菌种：从酱菜制品分离获得的乳酸菌和霉菌；赭曲霉（TCCC41060）、黄曲霉（CGMCC3.2890） 西北农林科技大学食品科学与工程学院微生物发酵与工程实验室保存。

1.1.2 培养基

培养基：乳酸菌筛选使用添加2 g/L碳酸钙的MRS固体培养基，乳酸菌培养使用MRS培养基，霉菌筛选使用马丁孟加拉红培养基，培养选用PDA培养基。

1.1.3 试剂

溶菌酶、蛋白酶K、酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液、氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）混合液等 北京索莱宝科技有限公司；rTaq酶 大连宝生物工程有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA凝胶回收试剂盒 杭州爱思进生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酱菜中乳酸菌和霉菌的分离与纯化

1.2.1.1 酱菜中乳酸菌的分离与纯化

将6 种酱菜样品无菌操作各称取鲜质量10 g，切成5 mm小丁，加入90 mL无菌生理盐水涡旋振荡3 min，然后取悬浮液进行梯度稀释至10－7，接着分别从10－4～10－7稀释度吸取1 mL加入无菌培养皿中，倒入50 ℃的含有碳酸钙的MRS固体培养基15～20 mL混匀后冷却至室温，放置于37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h。挑取有溶钙圈的菌落继续在MRS固体培养基上进行分离纯化[13]。将产生溶钙圈的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，染色阳性且过氧化氢酶阴性菌株初步定为乳酸菌[14]。甘油冷冻保藏。

1.2.1.2 酱菜中霉菌的分离与纯化

从以上用于乳酸菌分离的样品系列稀释液的10－2～10－5稀释度分别吸取200 μL菌悬液涂布于马丁孟加拉红培养基表面。置于恒温培养箱中，28 ℃培养3～5 d，挑取少许霉菌所产孢子到PDA平板上进行划线分离、纯化[15]。

1.2.2 霉菌鉴定

纯化的霉菌单菌落生长3～5 d后，待其产孢，用接种环挑取少量孢子点于PDA平板中心，在28 ℃连续培养3～5 d后观察菌落形态，生长缓慢的真菌培养7 d后观察菌落形态。然后进行显微形态观察，在载玻片上加1 滴乳酸石碳酸棉兰，挑取少量带孢子的菌丝，压片后显微镜下观察菌体菌丝形态[16]。挑选具有不同群体和个体形态特征的霉菌孢子进行保藏备用。

1.2.3 具抑制霉菌活性的乳酸菌初步筛选

1.2.3.1 霉菌孢子液的制备

选取霉菌分离实验中最常见的菌株——青霉菌作为乳酸菌抑制作用检测的测试菌，将待试青霉菌菌株接种在PDA斜面，28 ℃恒温培养7 d左右至大量孢子产生，加入5 mL灭菌生理盐水于斜面试管，涡旋振荡5 min，采用400 目无菌纱布过滤除去营养菌丝体[17-18]，收集的孢子悬液使用血球计数板计数，备用。

1.2.3.2 具有抑制青霉菌活性乳酸菌的筛选

使用双层平板法筛选对霉菌具有抑制活性的乳酸菌[19]。首先将固体MRS培养基倒入培养皿作为下层平板，待其凝固后，用接种环沾取生长至对数期的乳酸菌在平板上划两条长2 cm的平行直线，于37 ℃培养24 h，至长出菌苔。然后将含有孢子浓度为5×104个/mL的PDA培养基倒入培养皿中，覆盖在含乳酸菌菌苔的下层培养基上，于28 ℃培养72 h，检测乳酸菌生长条带周围是否出现抑菌圈。挑选具有抑菌效果的乳酸菌进行后期实验。

1.2.4 乳酸菌对酱菜中污染霉菌的抑制作用

1.2.4.1 无菌浓缩乳酸菌发酵液的制备

将乳酸菌以1%接种量接种，在37 ℃培养24 h，将发酵液在冷冻离心机中以3 000 r/min的转速离心12 min，取其上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去菌体，置于－80 ℃冰箱中冷冻12 h，经过真空冷冻干燥机浓缩，制备成10 倍浓缩液。

1.2.4.2 浓缩液抑制霉菌活性测定

采用打孔法测定抑菌活性[20]。用2.0 g/100 mL素琼脂作下层平板，在上层倾入孢子浓度为5×104个/mL的PDA培养基，待其凝固后，用直径为6 mm的无菌打孔器打孔，滴加2 滴素琼脂封底，稍后加入60 μL浓缩液，以10 倍浓缩MRS液体培养基为对照。28 ℃培养72 h，测量抑菌圈直径，检测浓缩液的抑霉菌活性。为了进一步检测乳酸菌浓缩液的抑霉菌活性，本实验对赭曲霉和黄曲霉也进行了抑菌测试。

1.2.5 乳酸菌抑制青霉菌有效成分分析

为了分析乳酸菌发酵浓缩液对青霉菌起抑制作用的有效成分，本实验通过蛋白酶处理实验，pH值调节实验和温度处理实验对3 株乳酸菌抑青霉菌的活性成分进行了分析。

1.2.5.1 蛋白酶处理对浓缩液抑制霉菌活性的影响

分别向浓缩液中加入终质量浓度为1 mg/mL的不同蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K），于37 ℃水浴2 h后取出，80 ℃水浴处理2 min使酶失活。采用打孔法检测蛋白酶处理后浓缩液的霉菌抑制活性，以未使用蛋白酶处理的浓缩液作为对照。

1.2.5.2 发酵液中有机酸对浓缩液抑制青霉菌活性的影响

用1 mol/L NaOH分别调节浓缩液pH值至4.0、5.0、6.0，采用打孔法测定处理后的浓缩液对霉菌的抑制作用，以未经调整pH值的浓缩液作为对照。

1.2.5.3 热处理对浓缩液抑制青霉菌活性的影响

将浓缩液置于60、80、100 ℃水浴中处理5 min，打孔法测定处理后的浓缩液对霉菌的抑制作用，检测抑菌物质热稳定性，以未处理的浓缩液为对照。

1.2.6 乳酸菌菌株的鉴定

1.2.6.1 DNA的提取

采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取乳酸菌的基因组DNA[21]。

1.2.6.2 乳酸菌16S rDNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增与测序

以乳酸菌菌株基因组DNA为模板，利用扩增细菌16S rDNA的通用引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1495r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’），对乳酸菌的16S rDNA进行PCR扩增[22]。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性45 s、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min[23-24]。PCR产物大小经过琼脂糖凝胶电泳检测验证后，将目标条带进行纯化，然后送北京英俊生物工程有限公司进行测序。

1.2.6.3 同源性分析与系统发育树的构建

采用核酸BLAST技术，将测序获得的序列信息与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站里的GenBank数据库进行对比，找到与所测序列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中获得已知菌株的16S rDNA基因序列，与所测菌株的16S rDNA序列一起，采用MegAlign（Clustal w）进行比对，绘制系统发育树，确定各菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与纯化

通过采用含有碳酸钙的MRS培养基对酱菜中的优势乳酸菌进行分离，经过48 h培养后，发现10－4稀释度的酱白萝卜和酱黄瓜中分别有10 个和4 个能产生溶钙圈的菌落，而其他4 种酱菜中没有出现产生溶钙圈的菌落。然后将以上14 个单菌落继续使用改良MRS平板进行划线分离纯化，获得纯化的乳酸菌疑似菌株。对14 株疑似乳酸菌进行编号，白萝卜酱菜中分离到的乳酸菌编号为：L511～L520，对酱黄瓜中分离得到的乳酸菌编码为：L541～L544。

2.2 霉菌的分离、纯化与初步鉴定

为了确定酱菜中主要的污染霉菌，本研究使用马丁孟加拉红培养基对酱菜稀释液中的霉菌进行分离，发现2 d后从酱海白菜、酱芥菜、酱红辣椒和酱大蒜的10－2稀释度菌悬液对应的平板上能长出霉菌菌落，5 d后产生有色孢子，而酱白萝卜和酱黄瓜中未能分离到霉菌菌落。将以上霉菌孢子及菌丝体生长特征相近的菌落数较多的一类或者两类霉菌挑出来进行进一步分离、纯化，纯化霉菌进行孢子悬液保藏，备用。然后对霉菌进行菌落特征及个体形态显微特征观察，初步确定其分类地位[25]。结果见图1及表1，本实验从酱菜中分离到的霉菌包括青霉、木霉、曲霉和根霉，其中青霉最为常见。

图1 霉菌显微特征观察（×400）Fig.1 Morphology of molds under microscope (×400)

表1 霉菌的菌落形态及显微观察Table 1 Colony morphology and microscopic morphology of contaminating molds in pickles

2.3 具有霉菌抑制活性乳酸菌的初步筛选

在对霉菌具有抑制活性的乳酸菌的筛选中，本实验使用从酱菜中分离的最常见的青霉菌作为测试菌，采用双层平板法对所分离到的14 株乳酸菌菌株进行初步筛选，检测其对霉菌的抑制效果，结果发现，其中3 株菌（分别为L511、L520、L544）对青霉具有明显的抑制作用（图2，以L544为例），而其他11 株菌抑制作用或者很差，或者根本没有抑制效果呈现。

图2 乳酸菌L544对青霉的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of lactic acid bacterium L544 on Penicillium

2.4 乳酸菌对酱菜中霉菌及常见真菌毒素产生菌的抑菌谱

本研究进一步检测了乳酸菌对酱菜中分离的霉菌和实验室保存的其他两种产真菌毒素霉菌——赭曲霉和黄曲霉的抑制效果，结果见表2。

表2 乳酸菌发酵液对酱菜中霉菌及常见产毒真菌的抑菌谱Table 2 Antimicrobial spectra of LAB culture supernatants to molds isolated from pickles and common toxigenic fungi

由表2可知，酱菜中的分离得到的3 株乳酸菌对酱菜中的多种霉菌均有较明显的抑菌效果，对青霉属F1及曲霉属F3的抑菌效果最好，抑菌圈直径均大于18 mm，木霉属F2的抑菌圈直径在6～18 mm之间，根霉属F4的抑菌圈直径大于12 mm。此外，3 株乳酸菌对食品中常见产毒霉菌也体现了较强的抑菌作用，在对黄曲霉的抑菌实验中，3 株乳酸菌作用的抑菌圈直径均在6～18 mm之间，而乳酸菌L520及L544对赭曲霉作用的抑菌圈直径均大于18 mm。

2.5 乳酸菌抑制青霉菌有效成分分析

本研究通过蛋白酶处理法、pH值调节法、高温处理法对乳酸菌抑制青霉菌的可能有效成分进行了分析，表3为乳酸菌浓缩液经过不同处理后的抑菌效果。

表3 不同处理方法对乳酸菌发酵浓缩液抑制青霉菌活性的影响Table 3 Effect of different treatments on the antimicrobial activity of concentrated LAB culture supernatants against Penicillium

由表3可知，3 株乳酸菌的发酵浓缩液经不同方法处理后其抑菌活性有不同程度的变化。在蛋白酶处理实验中，发酵浓缩液在经过胃蛋白酶及胰蛋白酶处理后抑菌活性没有改变，而它们均对蛋白酶K有一定的敏感度，与L520相比，L511与L544对蛋白酶K更为敏感。由于蛋白酶K属于切割性较广的高活性蛋白酶，与胃蛋白酶与胰蛋白酶相比，其作用的肽键范围更广，因此推测，上述3 株乳酸菌发酵浓缩液中的抑菌活性物质包含有蛋白质或者肽类物质。

由表3可知，在对乳酸菌发酵浓缩液的pH值调节实验中，当发酵浓缩液pH值调整为4.0时，L511的抑菌活性会受到一定影响（抑菌圈直径范围为（12 mm，18 mm]），但对L520、L544的抑菌活性几乎没有影响；当pH值调整为5.0时，L511抑菌活性消失，L520、L544的抑菌活性也受到较大影响（抑菌圈直径范围为（6 mm，12 mm]）；而当pH值调整为6.0时，3 株乳酸菌发酵浓缩液的抑菌活性均消失。由此可知，乳酸菌发酵浓缩液的抑菌活性受pH值变化的影响较大。

在对浓缩液的热处理实验过程中，浓缩液在经过60、80、100 ℃水浴处理5 min后其抑菌活性几乎不受影响（抑菌圈直径＞18 mm）。由此推测，3 株乳酸菌发酵浓缩液中的抑菌物质热稳定性较高。

2.6 16S rDNA序列同源性分析

2.6.1 PCR反应产物的检测及序列测定

用1%的琼脂糖凝胶对菌株L511、L520、L544的16S rDNA扩增产物电泳检测，经溴乙锭染色后，均在1 500 bp处出现荧光条带（图3），与预期结果一致。

图3 菌株L511、L520、L544的16S rDNA基因扩增电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of 16S rDNA from strains L511, L520 and L544

2.6.2 乳酸菌的鉴定

图4 菌株L511、L520、L544根据16S rDNA序列建立的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strains L511, L520 and L544 constructed based on 16S rDNA sequence analysis

将具有青霉菌抑制活性的乳酸菌株的16S rDNA的PCR产物测序后，进行同源性分析，构建系统发育树，以确定菌株的分类地位，结果见图4。所测序列输入GenBank与数据库进行比对，结果表明菌株L511的16S rDNA基因序列与弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）LA3有99%同源性，L520与清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）28-3有高于99%的同源性，而L544与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PLD1的同源性超过99%。依据16S rDNA基因序列的同源性分析，确定菌株L511为弯曲乳杆菌（L. curvatus），菌株L520为清酒乳杆菌（L. sakei），菌株L544为植物乳杆菌（L. plantarum）。

3 结论与讨论

本研究从不同酱菜中分别分离获得了乳酸菌和霉菌。在本研究中还注意到，能够分离获得乳酸菌的酱菜中没有分离到霉菌，而分离到霉菌的酱菜中，则没能分离到乳酸菌。本研究从酱菜中分离得到的3 株乳酸菌对酱菜中分离的一株青霉属菌株具有良好的抑菌效果。经16S rDNA序列分析，3 株具有抑制青霉菌的菌株分别为弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌和植物乳杆菌，说明了在酱菜中存在着乳酸菌的自然生长，而且还具有一定的多样性。继续检测3 株乳酸菌对其他几种从酱菜中分离的污染霉菌的作用，发现乳酸菌对酱菜中分离的这些霉菌都具有较好的抑菌效果，这也一定程度上说明了能分离乳酸菌的酱菜中分离不到霉菌的原因，而且3 株乳酸菌对产毒霉菌中的黄曲霉及赭曲霉也表现出了明显的抑菌作用。对乳酸菌抑菌活性有效成分的分析显示，抑菌活性成分对热稳定，对pH值变化敏感，对蛋白酶的处理也表现不同的敏感性，推测抑菌作用有效成分可能为小肽类和/或有机酸。由此可知，3 株乳酸菌在酱菜防霉变中可以起到良好的广谱抑菌作用，这对酱菜贮存具有重要意义。当前食品加工正向着低盐、低防腐剂甚至无防腐剂方向发展，乳酸菌不仅可以抑菌，而且可以提高风味和加强肠道微生态平衡，本实验筛选的抑制霉菌的乳酸菌既具有酱菜防腐方面的利用价值，同时可降低盐和防腐剂的用量，为进一步研究开发生物防腐提供了有价值的菌种资源。

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Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria Inhibiting Penicillium and Analysis of Their Antimicrobial Components

LI Yuan, WEI Xinyuan*, WANG Jing, DING Wu, ZHENG Fangyuan, HU Xianmiao, KOU Liping*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective: The aim of this study was to isolate and identify lactic acid bacteria able to inhibit Penicillium from various pickles. The antibacterial activity was determined against the dominant molds in pickles and toxin-producing fungi and the active compounds produced by the obtained isolates against Penicillium were analyzed. The molecular biological identification of strains was performed by molecular biological methods. Methods: By the double-layer plate method, lactic acid bacteria with antimicrobial activity against Penicillium were screened from the pickles. The inhibitory effects of lactic acid bacteria against fungi from the pickles and mycotoxin-producing fungi preserved in our lab were determined, and the active substances from lactic acid bacteria were analyzed by protease digestion, pH adjustment and heating. These lactic acid bacteria were then identified via 16S rDNA sequence analysis after PCR amplification. Results: Three strains were screened from 14 dominant lactic acid bacterial strains isolated from the pickles for high inhibitory activity against fungi isolated from the pickles and 2 toxigenic fungi. Treatment with different proteases and pH adjustment had different effects on the antibacterial activity of the concentrated culture supernatant of lactic acid bacteria, while three heat treatments did not affect the inhibitory efficiency. Three lactic acid bacteria were identified as L. curvatus, L. sakei and L. plantarum, respectively. Conclusion: Lactic acid bacteria screened from pickles have high inhibitory activity on Penicillium and some toxigenic fungi, suggesting that the strains can be used as biological preservative to extend the shelf life of pickles, and its antibacterial ingredients may be small peptides and/or organic acids.

pickles; lactic acid bacteria; fungi; antimicrobial component; antibacterial activity

Q935

A

1002-6630（2015）21-0150-06

10.7506/spkx1002-6630-201521029

2014-11-13

西北农林科技大学基本科研业务费专项资金项目（QN2011138）

李院（1990—），女，硕士研究生，研究方向为乳酸菌抑菌。E-mail：liyuan814515@163.com

*通信作者：魏新元（1971—），男，副教授，博士，研究方向为食品高新技术。E-mail：wheixinyuan@126.com

寇莉萍（1972—），女，副教授，博士，研究方向为果蔬加工。E-mail：kouliping8@hotmail.com