凝结芽孢杆菌抑菌物质的理化特性研究

赵钰，傅玲琳，王彦波

（浙江工商大学食品质量安全系，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江杭州310018）

凝结芽孢杆菌抑菌物质的理化特性研究

赵钰，傅玲琳，王彦波*

（浙江工商大学食品质量安全系，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江杭州310018）

以益生菌凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans LL1103为对象，研究了其生长情况与pH值和抑菌活性的关系，发现其最佳抑菌发酵时间为18h。制备了其抑菌产物粗品并测定其抑菌谱，结果表明，抑菌产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有明显的抑菌效果，具有广谱抗菌性。随后对抑菌产物粗品的理化性质进行了研究，发现它在MRS培养基中培养后，最适温度37℃，最适pH=6.0下具有最强的抑菌活性。此外，进行了抑菌物质的初步鉴定，在排除酸性末端产物和菌体的干扰后，用蛋白酶K等多种蛋白酶和过氧化氢酶去处理抑菌产物粗品，发现其对蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶较敏感，对氧化氢酶不敏感，初步推断抑菌物质的主要成分是对蛋白酶敏感的细菌素类物质。

益生菌；凝结芽孢杆菌；抑菌物质；细菌素

水产品营养物质丰富，在加工和贮藏过程中极易因微生物的繁殖而腐败变质。目前，在全球有近25%的食品因微生物问题而被污染，水产品也包括在内[1]。目前控制微生物污染主要采用化学方法和物理方法[2]，化学方法是在食品中加入防腐剂等化学物质，物理方法则主要是对食品进行超高压、电离辐射、臭氧等处理，这两种方法不同程度上容易引起二次污染、降低食品品质等问题[3]，因此，开发相对安全的微生物污染控制及防腐保鲜技术已成为目前国内外研究的热点。研究表明，乳酸菌可广泛应用于乳制品、蔬菜、水果、饲料及肉制品的发酵与防腐保鲜中。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）[4]又称为芽孢乳酸菌，是一类认为“普遍安全的”杆菌类乳酸菌[5-6]，对人体无害，且不改变食品自身的特性，具有较好的应用前景。研究表明，许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和过氧化氢外，还可产生一些具有抑菌活性多肽物质——细菌素（bacteriocin）[7-9]，具有可抑制腐败菌和致病菌生长的能力，进而对包括水产品在内的食品等起到防腐保鲜的效果[10-12]。凝结芽孢杆菌同样可以产生乳酸、凝结素等物质[13]。本实验室自行分离得到的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）LL1103是乳酸菌的一种，除了具有乳酸菌的特点外，还具有抗逆性强、耐高温、易储存等生物学特性，弥补了一般乳酸菌的不足。鉴于此，我们研究了凝结芽孢杆菌抑菌相关的理化特性，并对其抑菌物质做了初步鉴定，旨在为后续的应用研究和水产品防腐保鲜剂开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

凝结芽孢杆菌LL1103：浙江工商大学食品微生物技术重点实验室分离筛选自养殖大黄鱼，并保藏备用。

指示菌：大肠杆菌（E.coli）、腐败希瓦氏菌（Shewanella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。

1.1.2 主要药品和试剂

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、MRS液体培养基：青岛海博生物技术有限公司。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶：美国Sigma公司。

HCl、NaOH、乳酸等试剂均为分析纯级。

1.1.3 主要仪器和设备

台式恒温振荡器THZ-D：太仓市实验设备厂；pH计UltraBASIC：DENVER INSTRUMENT公司；超净工作台SW-CT-1FD：苏州净化公司；高速冷冻离心机Allegra X-30R Centrifuge：BECKMANCOULTER公司；立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50FBS：上海申安医疗器械厂；智能生化培养箱LRH系：上海一恒科技有限公司；酶标仪Versmax：Molecular Devices公司；超纯水装置：Millipore公司；电子天平：DENVER INSTRUMENT公司；电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；超低温冰箱：SANYO公司；4℃冰箱：西门子公司；数显恒温水浴锅HH-4：常州朗越仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及培养

超低温冰箱中取出本实验室保存的凝结芽孢杆菌菌种，于营养琼脂培养基上划线接种培养，37℃条件下，培养24 h，培养皿中挑取单一菌落并接种于营养肉汤培养基中，37℃条件下培养18 h。

指示菌的培养：按2%的接种量接种在营养肉汤培养基中，培养条件为30℃，24 h。

1.2.2 凝结芽孢杆菌抑菌产物粗品的制备

将活化的凝结芽孢杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃摇床培养18 h后，对发酵液高速冷冻离心（1 2000 r/min，20min，4℃），取上清液过0.22μm滤膜即为抑菌产物粗品，4℃保存备用。

1.2.3 抑菌效果的测定

抑菌试验采用牛津杯法：利用0.85%的生理盐水将指示菌制成约1×107cfu/mL（OD600≈0.3）的菌悬液备用，待营养琼脂培养基凝固后，吸取200μL指示菌菌悬液于平板上，用涂布棒涂布均匀，倒置培养1 h后放置牛津杯并在杯中加入抑菌产物粗品200μL，在4℃冰箱中扩散12 h，将培养皿在30℃下恒温培养24 h，测定抑菌圈直径。其中牛津杯内径约为6mm，每组均设定3个重复，用抑菌圈平均直径（mm）来评价抑菌活性。

1.2.4 实验设计

1.2.4.1 生长曲线、pH、抑菌能力的关系

将活化的凝结芽孢杆菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养，每隔2 h取样，用未接种的MRS液体培养基做空白对照，测定24小时内的OD600和pH，并测定每个时间点的抑菌能力。

1.2.4.2 抑菌谱

采用牛津杯法对各指示菌做抑菌试验，以抑菌圈平均直径（mm）来描述抑菌效果。

1.2.4.3 不同培养基培养对抑菌物质粗品抑菌能力的影响

将活化的凝结芽孢杆菌分别接种于NB培养基和MRS液体培养基中，37℃下培养18 h，制备抑菌物质粗品，测定抑菌活性，对比两者差异。

1.2.4.4 不同pH对抑菌物质粗品抑菌能力的影响

用3mol/LHCl和3mol/LNaOH调节抑菌物质粗品pH分别为：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，37℃下处理1 h，再调回pH至6.0，做牛津杯抑菌实验，观察抑菌圈大小。

1.2.4.5 不同温度对抑菌物质粗品抑菌能力的影响

将抑菌物质粗品分别在-20、4、37、80、121℃处理30min后测定抑菌能力，观察抑菌大小的变化。

1.2.4.6 抑菌物质的初步鉴定

研究有机酸的影响：用与抑菌物质粗品同样pH的乳酸作空白对照做抑菌实验，加以比较。

研究过氧化氢的影响：采用过氧化物酶法。

研究菌体及残留细胞的影响：将抑菌物质粗品用微孔滤膜过滤除菌后做抑菌实验，与全菌液进行抑菌能力对比。

研究蛋白酶和过氧化氢酶的影响：用3mol/LHCl和3mol/LNaOH调节pH至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和过氧化氢酶的最适pH，抑菌物质粗品与酶在37℃水浴条件下反应30min，再调回pH至6.0，研究不同酶处理对抑菌物质粗品抑菌活性的影响，以未经处理的凝结芽孢杆菌抑菌产物粗品为对照组。通过观察对照组和处理组抑菌圈大小的差异来判断该抑菌物质是否为蛋白类物质。

2 结果与讨论

2.1 生长曲线、pH、抑菌能力的关系

凝结芽孢杆菌在培养后4 h左右进入对数期，菌体浓度开始随时间指数型快速生长；培养后15 h左右，菌体开始进入稳定期，但稳定期维持时间不长；18 h之后，由于培养基中营养物质的消耗，代谢产物的积累，菌体的死亡率慢慢大于繁殖率，菌体进入衰亡期。

凝结芽孢杆菌在MRS液体培养基中的生长过程和pH变化过程如图1所示。

图1生长曲线与pH的关系Fig.1 Correlation between pH and growth antibacterial of bacterial strains

随着菌体进入对数期，菌液的pH从7.25左右开始迅速下降，证明有菌体生长过程中有酸分泌；且菌体在生长到6 h～8 h内菌体生长速度放缓，这可能是pH的降低暂时抑制了部分菌体的生长。随后，pH随着时间的延长而逐渐降低，培养到16 h时降到最低，但稳定在6.0左右。

图2显示的则是凝结芽孢杆菌生长曲线和抑菌能力之间的关系。

图2 生长曲线与抑菌产物生成的关系Fig.2 Correlation between production of products and growth of bacterial strains

培养后0～6 h内，凝结芽孢杆菌菌液并未表现出任何的抑菌活性；从8 h开始，菌液的抑菌活性随时间不短增加，并在18 h达到最高峰，随后便开始有所下降，但仍然具有明显抑菌活性。

综合图1、图2，我们发现当pH从一开始下降至6.1时，凝结芽孢杆菌菌液仍未出现任何抑菌活性，故酸可能不是凝结芽孢杆菌抑菌的主要成分，还需要进一步的鉴定。但我们可以确定的是，对该凝结芽孢杆菌的抑菌活性进行研究，最佳发酵时间应选在18 h左右。

2.2 抑菌产物粗品抑菌谱

凝结芽孢杆菌抑菌产物粗品对各指示菌的抑制效果见表1。

表1 抑菌产物粗品抑菌谱Table1 Inhibitory spectrum of the antibacterial crude extract

结果表明抑菌产物粗品对革兰氏阴性和阳性菌均有抑制作用，其中对常见的几种食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、腐败希瓦氏菌等抑菌效果十分明显，对枯草芽孢杆菌和沙门氏菌也有一定程度抑制作用。这说明凝结芽孢杆菌的抑菌产物具有广谱抗菌作用，这也让我们之后对其抗菌物质的研究有了更深远的意义。

2.3 不同培养基、pH、温度对抑菌产物粗品抑菌能力的影响

图3 不同培养基培养条件下抑菌物质粗品抑菌能力差异Fig.3 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract incubated from different medium

图3显示的是凝结芽孢杆菌活化后分别接种到NB培养基和MRS培养基中，37℃培养18 h后分别制取抑菌产物粗品，再选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌作为指示菌测定抑菌活性。

如图所示，在MRS培养基培养条件下抑菌产物粗品的抑菌活性显著高于NB培养基培养条件下抑菌产物粗品的抑菌活性（P＜0.05）。我们分析在MRS培养基培养条件下，有更多的抑菌分子被合成和释放出来，且抑菌效果明显。因此，制备凝结芽孢杆菌抑菌产物粗品的时候，用MRS液体培养基来发酵，能获得抑菌效果更好的粗品，含有更多的抑菌物质，便于我们之后对抑菌物质的鉴定和应用。

从图4中，我们可以看出凝结芽孢杆菌抑菌物质粗品在不同pH处理之后，在不同指示菌中抑菌活性的变化规律。

图4 不同pH对抑菌物质粗品抑菌能力的影响Fig.4 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract treated with different pH

针对三种不同指示菌来说，不同pH处理下，抑菌活性大小均无显著差异（P＞0.05）。我们发现pH=6.0时，抑菌产物粗品的抑菌活性最大，且结合之前测定生长曲线时测定的发酵液pH变化规律，我们认为该菌抑菌产物抑菌效果最佳的pH在6.0左右。从图5中，我们还发现，pH=2.0时抑菌产物粗品的抑菌活性要大于pH=4.0时，这可能是由于pH=2是酸性过大，它本身的酸性就对指示菌产生了抑菌作用。当pH=10.0时，抑菌产物粗品的抑菌活性完全消失，我们认为是碱性过大，有可能使我们抑菌物质中的酸被中和或抑菌蛋白被抑制。

图5结果显示，凝结芽孢杆菌抑菌物质粗品经不同温度处理后抑菌活性所呈现的规律。

图5 不同温度对抑菌物质粗品抑菌能力的影响Fig.5 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract treated with different temperature

对3种不同指示菌来说，不同温度处理后，抑菌活性大小均无显著差异（P＞0.05）。37℃条件下处理的抑菌产物粗品具有最高的抑菌活性，故把它作为最佳抑菌温度。我们发现当温度达到80℃时，抑菌产物还存在较低的抑菌活性，但当121℃处理之后，抑菌活性完全消失，证明抑菌物质以完全失活。但我们发现在温度较低的时候，抑菌产物仍然保有活性，特别是在4℃的条件下，抑菌活性还保持在一个比较好的水平，这也说明了我们的这种抑菌物质在冷藏保鲜[14-15]中可以作为一种生物保鲜剂来抑制腐败微生物的生长，具有实际应用的前景与价值。

2.4 抑菌物质的初步鉴定

乳酸菌产生的抑菌物质种类繁多，包括蛋白质类和非蛋白质类物质。其中蛋白质类物质主要是细菌素，非蛋白质类抑菌物质主要包括有机酸、过氧化氢等。因此本研究设计了对抑菌产物粗品的多种处理方式，并以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌为指示菌来初步鉴定凝结芽孢杆菌抑菌产物的组成。

酸性末端产物对抑菌活性的干扰：凝结芽孢杆菌是乳酸菌中的一种，而乳酸菌生长代谢过程中所产生少量乙酸和丙酸等有机酸，但大量生成乳酸，因此主要排除乳酸对抑菌效果的影响。抑菌产物粗品的pH为6.0左右，为了排除酸及酸性末端产物的干扰，用相同pH的乳酸来做对照。结果表明，相同pH的乳酸对改指示菌没有任何抑菌作用。说明此胞外产物中含有除有机酸之外的其他抑菌活性物质存在。

菌体及残留细胞对抑菌活性的影响：分别以最佳发酵条件下的菌液和抑菌产物粗品做抑菌实验，对比不同指示菌条件下两者是否存在显著差异。结果如图6所示，发现两个组的抑菌活性差异不显著（P＞0.05），说明残留的菌体及菌体细胞对实验不产生明显影响，主要是其他物质在起抑菌作用。

排除过氧化氢的干扰：采用过氧化物酶法对凝结芽孢杆菌的发酵过程进行检测。结果表明对菌株在发酵的4、8、12、16、20、24 h进行过氧化氢检测时，抑菌产物粗品反应后均无红色染料物质形成，说明没有过氧化氢的产生，排除了过氧化氢与抑菌活性的关系。

图6 抑菌物质粗品和菌液抑菌能力对比Fig.6 Comparison between the antimicrobial activity of antibacterial crude extract and fermented liquid

不同酶处理：图7显示了抑菌产物粗品在经过不同酶的处理之后，对3种不同指示菌的抑菌活性，对照组为未经处理的抑菌产物粗品。

图7 不同酶对抑菌物质粗品抑菌能力的影响Fig.7 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract treated with different enzymes

从图7中我们不难看出，在经历了蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶的处理之后，处理组的抑菌活性较对照组显著降低（P＜0.05）；而经过过氧化氢酶处理后，处理组的抑菌活性虽然有细微下降，但差异十分不显著（P＞0.05）。综合来说，抑菌产物粗品对蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶均敏感，对过氧化氢酶的敏感性则较低，这不仅说明抑菌物质不是过氧化氢或细菌发酵过程中产生者过氧化氢量极低，更说明了我们的凝结芽孢杆菌能起到抑菌作用，很有可能是它在分泌一种胞外的细菌素类物质。

3 讨论

我们的研究对象凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）LL1103[16]分离自养殖大黄鱼，其抑菌产物粗品对大肠杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等水产品中主要腐败菌具有良好抑菌效果，对沙门氏菌等这些常见食品腐败菌也都表现一定抑菌效果。这说明该菌株分泌的抗菌物质在食品中作为生物保鲜剂尤其是水产品中的生物防腐保鲜剂存在广阔前景。

在对其抑菌产物粗品的理化性质进行分析的过程中，我们发现抑菌产物粗品的最佳抑菌温度在37℃，但发现其在4℃的条件下仍保持了较高的抑菌活性，这说明该物质在水产冷藏保鲜的应用中具有一定的潜力。此外，有研究表明，水产品在保鲜过程中pH处于偏中性条件，后期达到弱碱性条件，而大多数乳酸菌产生的细菌素在碱性条件下抑菌活性很低，抑制不了腐败菌的生长。我们研究中的抑菌产物最适pH为6.0，而在pH=8.0时仍保有抑菌活性，这说明我们的菌在水产保鲜中有了更大的可能。

最后在排除酸性末端产物、菌体干扰和过氧化氢的干扰后，我们用蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理了抑菌产物粗品，发现其抑菌活性都受到很大的影响，代谢物质中含有对蛋白酶敏感的细菌素类物质。

1998年，B.Hyronimus[17]等发现凝结芽孢杆菌I4菌株能分泌抗菌肽物质——凝结素。凝结素经60℃处理90min，pH在4.0～8.0的条件下，仍保持稳定且不受α-淀粉酶、酯酶和有机溶剂（10%，V/V）的影响，对肠球菌、明串珠球菌、李斯特菌和小球菌等有抑制作用。2008年，Riazi[18]等在Bacillus coagulans ATCC 7050中发现了一种新型的抗菌蛋白lactosporin，对该抗菌蛋白研究表明其能有效的抑制某些致病菌的生长，并且对人身体安全。同年，Emad[19]等在废水中筛选出一株具有较强抗菌活性的凝结芽孢杆菌，其能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌，也能够抑制酵母菌的生长。对该抑菌物质研究，发现其是一种分子量在7.5 KDa的类细菌素，由于其抑菌的广谱性和热稳定性可以应用于食品的防腐。2001年，Cintas[20]等根据细菌素结构、分子量的大小、热稳定性和抑菌谱等方面的不同，把乳酸菌细菌素分为硫醚抗生素、不包含羊毛硫氨酸的小分子多肽类细菌素、大的热不稳定蛋白质类细菌素3类。

因此，对我实验室凝结芽孢杆菌发酵得到的抑菌物质中疑似存在的细菌素还需要进行进一步的分离纯化及鉴定，为其在食品中的防腐保鲜再建立起一定的理论基础。

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Physiochemical Properties of Antibacterial Substance Produced by Bacillus coagulans LL1103

ZHAO Yu，FU Ling-lin，WANG Yan-bo*
（Food Quality and Safety Department，Zhejiang Gongshang University，Key Laboratory of Microbial Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

In the present study，the relationship among growth condition，pH and bacteriostatic activity of probiotics Bacillus coagulans LL1103 was examined，and the optimal fermentation time for antibacterial substance producing was 18 h.The antibacterial crude extract was then prepared for antibacterial spectrummeasuring.The results showed that the extract had a broad spectrum of significant bacteriostatic activity，including activities against gram-negative bacteria and gram-positive bacteria.In addition，the maximal bacteriostatic activity of this extract was observed by incubating B.coagulans LL1103 in MRS medium at37°C，pH 6.0.Furthermore，we found that antibacterial product was sensitive to protease K，trypsin and pepsin，but not hydrogen oxidation enzymes.Thus，we speculated that the main ingredients of antibacterial product was a kind of bacteriocin which was sensitive to proteases.

probiotics；Bacillus coagulans；antibacterial substance；bacteriocin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.007

2014-09-02

赵钰（1989—），男（汉），硕士，研究方向：食品质量与安全。

*通信作者：王彦波（1978—），男（汉），教授，博士，致力于水产品质量与安全的研究。