简易细胞块和细胞芯片的制作方法及应用价值

曾宇婷，吴共发，林俊汕，郑娜芬，韩静静，黄绮亭，区瑞章，李海刚,增城市人民医院/中山大学孙逸仙纪念医院增城院区病理科，广东 广州 5300；中山大学附属孙逸仙纪念医院病理科，广东 广州 500

细胞块的制作方法已经有不少报道，包括利用凝血酶［1］、琼脂糖［2］或鸡蛋清［3，4］进行包埋，或离心沉淀法［2，5］，但前两者需要特殊物质进行包埋，不利于就地取材原则，而离心沉淀法在标本有黏液等情况时细胞会不成团导致制作失败。细胞芯片是生物芯片中的一种，具有类似组织芯片的功能，有针对科研实验的细胞芯片制作方法[6-7]，但不适用于临床细胞标本；有利用组织芯片原理制作细胞芯片的报道［8-9］，但这些方法同样存在某些不足，如需要专门设备，技术要求高；有研究者发明了细胞芯片制备仪并申请了专利［10］，但该制备仪尚需技术完善、有专利保护，尚未得到推广应用。本研究采用简易方法制作细胞块和细胞芯片，收到了满意的效果，本文就制作过程中的主要技术环节和应用体会介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2013年12月～2014年6月增城市人民医院和中山大学孙逸仙纪念医院临床各科室送检的细胞学标本，其中胸腔积液38例，腹腔积液26例，EP管、离心管、磷酸盐缓冲液（PBS）、各种即用型免疫组化抗体、即用型二步法免疫组化广谱检测试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新公司；细胞原位凋亡检测试剂盒（TUNEL assay）购自瑞士Roche Diagnostics；其他耗材和仪器均为病理科日常工作所需。

1.2 细胞块制作

细胞学标本直接移入50 ml离心管，2000 r/min离心10 min，去掉液体，加入6～10 ml醋酸消化液（消除粘液和红细胞），振动器震荡10 min，2000 r/min离心10 min，去掉液体，如果细胞团块过大，可分装至其他EP管，调整细胞沉淀团块直径约3 mm，加入95%乙醇，2000 r/min离心10 min，去掉上清，轻轻加入4%中性缓冲甲醛，2000 r/min离心10 min，用病理切片刀将EP管底部切开，小镊子轻轻将细胞块顶出，包在擦镜纸并染伊红，放入包埋盒中，进行常规冲洗、脱水、透明、浸蜡。

1.3 细胞芯片制作

将浸蜡后待包埋的各细胞块和不锈钢包埋模一同放入熔融的石蜡缸中，小心按照预先编排好的位置将细胞块排列在不锈钢包埋模，轻轻将包埋盒盖在不锈钢包埋模上（图1），用小镊子钳住包埋模边缘，保持不锈钢包埋模与地平线平行，将其平稳地取出蜡缸，放置于与地平线平行的台面，待其凝固后即制出细胞芯片。注意操作全过程要小心谨慎，动作平稳，以免碰乱细胞块排列顺序。

图1 细胞芯片制作示意图

1.4 常规HE染色、免疫细胞化学和TUNEL检测

细胞块及细胞芯片均行HE染色，方法与组织常规HE染色相同。蜡块3μm厚切片行免疫细胞化学检测，方法与组织学免疫组化相同，操作按照试剂盒说明书进行。TUNEL检测操作步骤参照说明书进行，方法与石蜡组织的TUNEL检测过程相同。

2 结果

2.1 HE染色效果

HE染色显示细胞块及细胞芯片中的各种细胞着色清晰，细胞质和细胞核显示良好，背景干净，镜下易于观察（图2A）。

2.2 免疫细胞花学染色和TUNEL检测效果

免疫细胞化学染色显示细胞块及细胞芯片中的各种抗体在细胞染色表达位置正常，染色效良好（图2B～C）。TUNEL检测结果显示细胞质染成淡棕黄色，发生凋亡的细胞核呈棕褐色，未发生凋亡的细胞核经过苏木素染色后呈蓝色（图2D）。

图2 细胞块及细胞芯片应用价值

3 讨论

细胞病理检查已广泛用于帮助临床诊断肿瘤性病变。目前浆膜腔积液常规使用离心涂片法制片，制出的片质量欠佳，且不能进行免疫细胞化学检查，影响了细胞学检查的进一步发展。细胞块的出现很好的解决了免疫细胞化学检查的问题。细胞块的制作方法包括利用某种特殊物质对细胞进行包埋，如凝血酶［1］、琼脂糖［2］鸡蛋清［3，4］，或者离心沉淀法［2，3］，利用特殊物质进行包埋虽然方法可行，但不利于就地取材原则，而离心沉淀法在标本有黏液等情况时细胞会不成团导致制作失败。本研究在实践中发现离心沉淀法在标本具有黏液、坏死物、较多红细胞等时才会导致细胞无法成团，为此在此法基础上加入醇酸消化液步骤，经过醋酸消化后的标本均能离心成团制成细胞块，而醋酸消化液是宫颈TCT制片等必须的试剂，取用方便，无需特殊购买。

细胞块存在某些不足之处，例如一次只能检测一个标本，当许多标本需要检测时，则需要逐个检测，浪费人力物力和时间。并且当标本量多时，对多张切片进行实验易造成人为误差的出现，影响结果的客观性及准确性。而细胞芯片的出现弥补了细胞块这些缺陷。本研究从细胞块具有体积小的特点，摸索出一种简便的手工制备细胞芯片方法。该方法所需耗材、试剂、仪器均为日常病理科所具备，将细胞学标本按照上述方法制成细胞块后，将浸蜡的细胞块按照预先设计好的位置排列在包埋模上，待石蜡凝固后即可制作出石蜡细胞芯片，整个流程具有非常好的可靠性和稳定性、操作简单方便、不需要特殊仪器、价格低廉。制作出来的细胞芯片点阵完整，排列均一，熟练操作后可以制备出多至60个点阵的芯片，经过验证，证实各细胞结构保存良好、染色细胞颜色鲜艳，染色效果良好，免疫组化染色及TUNEL染色的阳性表达效果好，背景清晰，抗原保存良好，具有与石蜡组织一样能永久保存的特点。

此法有几个需要注意的环节。首先标本要加入醋酸消化液，特别是对血性、浑浊或带黏液的标本要充分消化，这样细胞才能成团，消化干净的判断方法是细胞块肉眼观察质地紧实，与EP管交界边缘锐利；另外细胞块大小以直径3 mm为宜，太小则可咨诊断的细胞信息少，过大则在制作细胞芯片是比较占空间；初学者在制作细胞芯片时一次以10～20个点阵的芯片量为宜，否则点阵过多在操作不熟练情况下可能导致细胞芯片编号混乱而功亏一篑，熟练后方可一次制备更多点阵的芯片。本法不足之处是在将细胞块排列在包埋模时假如操作欠熟练可能有失误发生，但我们认为在熟练后可以避免此情况发生的。总之，该简易手工制备细胞块和细胞芯片方法是省时、价廉、简便的检测方法，可以得到质量稳定可靠，便于长期保存的细胞块和细胞芯片，能满足临床和科研需要，特别适用于一般病理科、基层单位或条件简陋的实验室，值得推广应用。

［1］柳玮华,余小蒙,周小鸽.凝血酶细胞块简捷制备法［J］临床与实验病理学杂志,2007,23(6):721-722.

［2］张婉仪,罗丽花,刘惠娟,等.胸腹水细胞块制作技术及应用［J］.临床医学工程,2014,21(1):44-5.

［2］郑 晖,颜亚晖.介绍一种简单适用的胸腹水脱落细胞石蜡包埋法［J］.中国组织化学与细胞化学杂志,2003,12(4):445-6.

［4］彭先高,罗孟疌.浆膜腔积液脱落细胞学检查方法的改进［J］.临床与实验病理学杂志,26(4):504-5.

［5］吴才良,龙琼先,刘欣雅,等.免疫组化染色在体液细胞块中的作用［J］.成都医学院学报,2013,8(3):316-7.

［6］ Ziauddin J,Sabatini DM.Microarrays of cells expressing defined cDNAs［J］.Nature,2001,411(6833):107-110.

［7］ Koh WG,Itle LJ,Pishko MV.Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays［J］.Anal Chem,2003,75(21):5783-9

［8］罗 毅,张露凝,李 军.一种优化的琼脂糖包埋细胞微阵列的制备方法［J］.基础医学与临床,2004,24(6):76-8

［9］翟德忠,柴玲霞,冯万文,等.应用组织芯片技术构建细胞免疫芯片［J］.中国现代医学杂志,2009,19(2):213-4

［10］李文生,郭党学,王岐山,等.细胞芯片制备仪的研究及应用［J］.西北大学学报（自然科学版）,2009,39(6):1006-100