恩施黑猪血液指标测定分析及和CXCR4基因多态性的关联分析

向 宇，李宗明，李佳萍，刘国平，李长春，李新云，赵书红

（1.华中农业大学 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；2.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025）

恩施黑猪血液指标测定分析及和CXCR4基因多态性的关联分析

向 宇1，李宗明2，李佳萍1，刘国平2，李长春1，李新云1，赵书红1

（1.华中农业大学 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；2.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025）

为了解探究恩施黑猪这一地方猪种的免疫特性，采集了湖北某猪场的218头免疫系统成熟的纯种恩施黑猪，测定了24项血液五分类指标并与农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室对其他中外猪种的血液参数值进行了分析比较；对免疫候选基因CXCR4进行了多态性分析并发现SNP位点g542.C＞T和部分血液指标显著关联，为恩施黑猪的抗病育种提供了潜在的分子标记。

恩施黑猪；血液指标；CXCR4；关联分析；分子标记

恩施黑猪是原产自湖北省西南部恩施自治州的地方优良猪种，具有良好的抗逆性和抗病力。目前对于恩施黑猪这一地方猪种的血液指标研究不多，大部分集中在对其生产性能和胴体品质等方面的开发利用，尚未见对其免疫候选基因分子标记的发掘。本试验希望通过对黑猪血液指标的测定和分析，结合免疫候选基因SNP位点的筛选，为恩施黑猪的选育提供支持。

1  材料和方法

1.1 试验材料

本试验材料样品来自于湖北省某猪场的218头纯种恩施黑猪，按照统一标准进行饲养，日龄在五月龄以上，免疫系统均已成熟且健康状况良好，执行统一的免疫程序，健康状况良好。

1.2 血液采集和血液指标的测定

用绳套或保定器套住恩施黑猪上颌部，自然保定，将一次性静脉采血针穿刺针头插入黑猪耳静脉，通过透明硅胶软管将另一头接入带抗凝剂EDTANa2的真空负压抗凝管中，待血液至5 mL刻度处拔出穿刺针头，待软管内血液流入负压管内拔出管塞穿刺针头，轻微颠倒试管以便血液和抗凝剂重复混匀，放置于4 ℃短暂保存。

4 h内将血样用BC-5800全自动血液分析仪进行血液五分类检测，上机检测前需再次摇匀。采血时间统一在凉爽的早晨猪只尚未进食之前，便于减少猪只应激和保持血液指标的稳定。

血液五分类检测的数据包括24项参数指标：白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞分布宽度标准差（RDW-SD）、红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)、血红蛋白(HGB)、平均血红蛋白量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、大型血小板比率(P-LCR)、中性细胞比率(NEUT%)、淋巴细胞比率(LYMPH%)、单核细胞比率(MONO%)、嗜酸性粒细胞比率(EO%)、嗜碱性粒细胞比率(BASO%)、中性细胞数(NEUT#)、淋巴细胞数(LYMPH#)、单核细胞数(MONO#)、嗜酸性细胞数(EO#)、嗜碱性细胞数(BASO#)。

1.3 数据分析比较

应用SPSS 17.0统计软件分析所有血液指标，计算血液指标的平均值、中值、标准差，与中国其他地方猪种及外来引进猪种的相同血液指标进行分析比较。其他中外猪种的血液指标来自文献报道：杜洛克、大白猪、二花脸[1]、通城猪[2]。

1.4 DNA提取，CXCR4基因扩增和表型关联分析

保定恩施黑猪，读取耳号或耳牌记录个体信息，用耳号钳夹取恩施黑猪耳组织，剪下的耳组织样用镊子装入2 mL EP管中，采用天根生化科技有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit（离心柱型），按照说明书步骤提取。提取DNA后进行琼脂糖凝胶电泳检测和浓度测定。

根据已报导的文献和本实验室前期工作，用Primer 5设计了CXCR4基因外显子区域的3对引物送上海生工公司合成，引物信息如表1所示。

PCR反应体系为总体系10 µL，包括PCR Mix 5 µL，正向引物和反向引物各0.3 µL，DNA模板1 µL（50 ng/µL），ddH2O 3.4 µL。

PCR反应过程为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火温度（52～57 ℃）40 s，72 ℃延伸40 s，重复35个循环，最后72 ℃5 min，低温4 ℃保存。

2  结果

2.1 恩施黑猪血液五分类指标测定结果

恩施黑猪血液五分类指标测定结果如表2所示。之前相关文献统计的地方猪种的血液五分类指标，白细胞数（WBC）参考范围为10.73～33.13，红细胞（RBC）参考范围为5.15～8.12，血红蛋白（HGB）参考范围为96.03～177.52，血小板（PLT）参考范围为172.61～443.88[3-5]。本次五分类测定的平均结果基本处于参考范围之内，但部分极值超出了参考范围。

2.2 恩施黑猪血液指标相关分析结果

对恩施黑猪血液指标进行相关分析，结果如图1所示。白细胞五分类中每类型的细胞即淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞的数目与自身细胞比率存在极显著的正相关（P＜0.01），且相关系数分别为0.691，0.839，0.903，0.769和0.929。白细胞数目和淋巴细胞比率、嗜酸性粒细胞比率、嗜碱性粒细胞比率、红细胞数、血红蛋白、红细胞压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白量浓度均存在显著的负相关（P＜0.05），而和中性粒细胞比率、中性粒细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数存在显著的正相关（P＜0.05）。淋巴细胞比率和中性粒细胞比率存在显著的负相关（P＜0.05），相关系数为-0.7，中性粒细胞比率和其他几种白细胞比率同样存在显著的负相关（P＜0.05）。此外红细胞和血红蛋白、红细胞压积间存在显著的正相关（P＜0.05），血红蛋白与红细胞压积间也存在显著的正相关（P＜0.05）；平均血红蛋白量和红细胞平均体积间同样存在显著的正相关（P＜0.05），平均血小板体积和大型血小板比率间存在极显著的正相关（P＜0.01）血小板分布宽度与血小板及血小板压积存在显著的负相关（P＜0.05）。

表1 候选基因CXCR4引物信息

表2 恩施黑猪血液免疫指标总体统计

图1 血液指标间的相关系数

2.3 恩施黑猪和其他猪种血液指标比较结果

将恩施黑猪和其他中外猪种相同的血液指标进行方差分析，结果恩施黑猪在WBC、RBC、HCT、MCV、HGB、LYMPH%、LYMPH#指标上均显著高于大白猪群体和杜洛克群体，在MCH、MCHC、PLT、PCT指标上显著高于二花脸群体。在红细胞和白细胞数目上与通城猪无显著差异。

2.4 CXCR4基因SNP位点和血液指标关联结果

采集恩施黑猪耳样提取DNA，随机选取10个恩施黑猪基因组DNA混合成的DNA pool，根据设计的引物进行PCR扩增。将扩增PCR原液送公司测序，使用Seqman对峰图进行分析，结果发现 CXCR4基因第2外显子上发现一个g.542 C＞T的SNP位点。通过直接测序法进行基因分型，将该位点分型结果和血液指标进行关联分析，结果如表所示。该位点和WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT显 著 关 联（P＜0.05）。 其 中CC基因型个体的WBC、NEUT%、NEUT#、PCT均值显著高于其他型个体（P＜0.05），TC基因型个体的LYMPH%、LYMPH#、PLT、PCT均值显著高于其他型个体（P＜0.05），MONO%、HGB均值显著低于其他型个体。

表3 CXCR4基因SNPg.542C＞T与表型性状的关联

3  讨论

血液指标特别是五分类指标能有效反映机体的免疫状态，从生理角度来说，血红蛋白本身是红细胞中的唯一非膜蛋白，由尚未成熟的红细胞核糖体产生，两者在数量上呈现显著相关性；本次五分类测定中，这两者的均值处在参考范围里的较高，白细胞和中性细胞数、中性细胞比率呈显著正相关(P＜0.05)，可能是骨髓干细胞分化的白细胞中，中性粒细胞寿命最短，骨髓造血能力大部分用于中性粒细胞的供给，机体正常水平时中性粒细胞和白细胞数目变化趋势呈现一致的一种体现[4]。和免疫功能有关的大部分细胞如淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞均存在不同程度的相关，表示机体的免疫系统是一个相互作用复杂的整体。在临床上部分血液指标的急剧升高或降低可以作为产生疾病的征兆，但仍需要具体的抗原检测。总之，了解血液指标的正常范围波动和不同指标间的相关性有利于我们把握畜群的健康状态。

在中外猪种的血液指标比较中发现，恩施黑猪与杜洛克、大白猪这类引入品种在多项指标上均存在显著差异，而与二花脸、通城猪这类中国地方猪种在红细胞、白细胞数目上无显著差异；这充分表明了中国地方猪种和国外引入品种在免疫性状上的差异同样体现在不同类型的血细胞数目上。之前有研究表明，中外猪种的免疫细胞数目存在显著性差异，例如梅山猪和大白猪的单核细胞及中性粒细胞[5]。而中国地方猪种内部血液指标的差异则主要集中在血红蛋白和红细胞分布上，这可能与不同地方猪种分布的不同区域和环境有关，同时也要考虑个体和品种之间的差异对不同血液指标的影响。

通过候选基因法发现了CXCR4基因第二外显子上发现一个g.542 C＞T的SNP位点与WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT显著关联（P＜0.05）。CXCR4基因是趋化因子受体家族成员之一，趋化因子受体4又被称为融合素、CD184。CXCR4的天然配体是基质细胞衍生因子CXCR12，两者相互作用形成的CXCR4/SDF-1生物学轴在参与细胞迁移、胚胎发育、肿瘤转移与增殖、免疫调节炎症反应、细胞凋亡等众多生理病理过程都有着重要的意义[6]。已有研究也证实在CXCR4基因缺失的小鼠体内B细胞前体细胞减少，而在血液中却明显增加。骨髓内颗粒细胞也减少，但在血液中未成熟颗粒细胞明显增加[7]。同样有研究表示，CXCR4基因的不同SNP单倍型和HIV病毒、霍金奇淋巴癌、白血病感染等血液疾病和肿瘤感染有显著相关，而且影响了感染后的白细胞数目变化及白细胞迁移情况。

因此，发现的CXCR4基因该SNP位点可能用于探究血液指标变化，作为恩施黑猪免疫候选分子标记应用于该品种的选育。

[1] 刘向东，樊斌，赵云霞，向安静，朱猛进，彭中镇，赵书红. 中国地方猪二花脸与国外品种仔猪血液参数差异比较分析.[J] 中国猪业，2013，S1：202-203.

[2] 刘榜，张庆德，李奎，樊斌，官红平，彭中镇，徐三平，杜亚球. 通城、瑞典长白、英国大白及其三元杂种猪部分免疫性状研究. [J] 畜牧兽医学报，2005，07： 35-38.

[3] 赵拴平，王睿琪，唐中林，昝林森，李奎. 3个地方品种猪血液生化指标分析. [J]中国畜牧兽医，2012，39，2：96-99.

[4] 金伯泉. 细胞和分子免疫学[M]. 第2版.北京：科学出版社，2001.

[5] Clapperton M，Bishop SC，Glass EJ. Innate immune traits differ between Meishan and Large White pigs.[J] Veterinary immunology and immuno pathology.2005，104：131-144

[6] Kawabata K， Ujikawa M， Egawa T，et al.A cell-autonomous requirement for CXCR4 in long-term lymphoid and myeloid reconstitution.[J] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1999，96：5663-5667.

[7] 王宜青. SDF-1/CXCR4轴以及MCP-1/CCR2轴对小鼠骨髓间充质干细胞迁移及归巢的影响[D]. 苏州大学， 2014.

2015-06-23）

湖北省重大科技创新计划产业化项目（2014ABC012）、湖北省杰出青年基金（2014CFA024）和教育部科技学技术项目（113048A）