香菇菌富硒液体发酵及三种胞外酶活性变化

王艳梅，吴 艳，王雅珍，李彩霞

(1.黑龙江工业学院环境工程系，黑龙江鸡西158100;2.江苏宿迁经贸高等职业技术学院社会服务系，江苏沭阳223600)

硒是人体必需微量元素，是GSHPx(谷胱甘肽过氧化物酶)和TrxR(硫氧还蛋白还原酶)等含硒酶重要组成部分［1］，具有提高人体机体免疫能力、抗肿瘤、缓解体内重金属蓄积、抗衰老和防止心脑血管疾病等活性［2］。人体只能从食物中获取硒，从谷物和蔬菜摄入硒占总量的85%左右。我国72%地区为不同程度缺硒区，低硒地带造成农产品硒含量低，使当地居民膳食硒摄入量远低于中国营养学会推荐硒摄入量最低值50μg·d－1，因此提高日常食品硒含量尤为重要。有机硒比无机硒具有较高生物活性和较低毒性，成为当今研究热点［3］。香菇菌丝体对无机硒有较强富集和转化作用［4］，香菇又具有增强免疫力、抗肿瘤、降血脂、抗血栓、健胃保肝、预防佝偻病和防治贫血等功能［5］，因此，生产研发富硒香菇对健康饮食有重要意义。

本文研究香菇菌在添加不同浓度Na2SeO3的发酵液中，对硒的富集及转化能力，同时检测发酵6天后淀粉酶、羧甲基纤维素酶(CMC)、漆酶活性，为药食同源富硒香菇的开发利用提供参考。

1 材料与试剂

1.1 实验材料

香菇菌购于黑龙江五常市东北食用菌研究所。

1.2 培养基

(1)斜面种子培养基(PDA) 马铃薯浸出液200g·L－1，葡萄糖20g·L－1，琼脂15 g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，pH自然。

(2)液体种子培养基 马铃薯浸出液 200g·L－1，葡萄糖 20g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，KH2PO41g·L－1，MgSO4·7H2O，0.5 g·L－1，pH=6.5;(3)摇瓶发酵培养基:糊精［6］20g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，KH2PO41g·L－1，FeSO4［6］0.5 g·L－1，CaCl20.5g·L－1，pH=6.5。

2 实验方法

2.1 香菇菌富硒培养

2.1.1 种子斜面培养

PDA琼脂培养基做好后分装进试管，120℃、0.12Mpa灭菌30min，趁热摆斜面;待培养基冷却至室温，原种试管中取出约1cm2菌丝块接种于斜面培养基，置25℃培养箱中培养12d，4℃低温保藏。

2.1.2 菌种活化

取4℃保藏的菌种斜面，25℃培养箱活化12h。

2.1.3 液体种子培养

从以活化好的香菇试管菌中1cm2接入80mL(500mL三角瓶)分别含有Na2SeO3的10、20、30、40、50 μg·mL－1的液体培养基中，25℃、150r·min－1摇床培养6d制备成种子培养液，以不添加Na2SeO3液体培养基为对照。

2.1.4 液体发酵培养

以8%接种量将种子培养液转接入 100mL(500mL三角瓶)分别含 Na2SeO3的60、70、80、90、100 μg·mL－1液体培养基中，25℃、150 r·min－1摇床6d发酵培养，以不添加Na2SeO3液体培养基为空白对照。

2.2 香菇菌丝体干生物量及菌球直径测定

收集100mL发酵液菌丝体，5000r·min－1离心10min，蒸馏水洗三次得菌丝体。用移液管取1mL发酵液，显微观察测定，以随机抽取10个菌球直径算术平均值作为菌球直径［7］。将菌丝体置60℃恒温真空干燥箱，烘干至恒重，电子天平称重，即为菌丝体干生物量［8］。

2.3 样品有机硒含量测定

2.3.1 绘制硒标准曲线

准确称量2.194g干燥的Na2SeO3，蒸馏水溶解并定容至1L，制备成含硒1g·L－1的标准溶液储备液。取此储备液 1mL，加蒸馏水定容至 200 mL，此硒标准应用液含硒 5μg·mL－1。分别取0、2、4、6、8、10 mL 硒标准应用液，置于125mL分液漏斗中，用水稀释成40mL，用1:1的HCl调节pH2～3，加入EDTA－2Na溶液2mL，再加入3，3，–二氨基联苯胺溶液2mL，摇匀。置暗处50min，取出，用10%NaOH 调节 pH7.0～7.5，准确加10mL甲苯，摇荡3min，静置分层，甲苯层置于分光光度计波长420nm处测定其吸光度［9］，绘制标准曲线。

2.3.2 样品无机硒的去除

准确称取烘干菌丝体0.2g，加入pH=8.6三羟甲基氨基甲烷－盐酸－甘油缓冲溶液，加入适量SiO2充分研磨，显微镜检，待细胞完全破碎后装入MD34－3500［10］透析袋内，于去离子水中透析。取透析外液，加入15%(质量比)半胱氨酸溶液摇匀静置，加1～2滴亚甲基蓝溶液，30～60s不褪色［11］证明无机硒已除净。

2.3.3 样品有机硒含量测定

完全转移透析内液于锥形瓶中，加入(VHNO3:VHClO4)混合酸5 mL，于可控温电热板上加热，及时补加混酸，当消化至样液呈无色通明为止。冷却，消化液转入烧杯，调pH为7.0，最后将溶液定容到50mL容量瓶中，按2.3.1的方法测样品有机硒含量。

2.3.4 样品总硒含量测定

准确称取烘干菌丝体0.2g，按2.3.4方法测总硒含量。

2.4 三种酶活性测定

香菇是木腐菌，对多糖物质的降解主要依赖纤维素酶和木质素酶［12］，这些酶活性强弱一定程度上决定菌丝体对培养基物料的生物转化［13］，取培养6天发酵液5mL，于4℃以下以4000 r·min－1离心10min，上清液即为粗酶液［14］，漆酶活性测定采用ABTS法［15］，淀粉酶、羧甲基纤维素酶活性测定参照回晶的方法进行［16］。

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

以硒标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制硒标曲线如图1，回归曲线线性方程为:

y=0.089x －0.005，回归系数 R2=0.9966。

图1 硒标准曲线

3.2 不同Na2SeO3浓度对香菇液体种子培养生物量的影响

表1 不同Na2SeO3浓度对香菇液体种子培养生物量的影响

从表1可以看出，发酵液中添加Na2SeO3，无论浓度多大，对液体种子生长都抑制;其中Na2SeO3为30μg·mL－1菌丝体生物量最大，为 0.86 g·50mL－1，Na2SeO3为 10μg·mL－1菌丝球直径最大，为 0.98mm。

镜检观察，当Na2SeO3为30μg·mL－1，菌球边缘菌丝分支细密，菌丝粗壮。综合菌丝直径与菌丝干生物量，选

Na2SeO3为30μg·mL－1液体种子为继续发酵用。

3.3 发酵液中添加不同浓度Na2SeO3对香菇菌富硒效果的影响

表2 不同Na2SeO3浓度对香菇菌液体发酵富硒效果的影响(X ±SD，n=3)

从表2中可以看出，添加Na2SeO3对菌丝干生物量、总硒含量、有机硒含量、有机化率都有促进作用，比不添加Na2SeO3相应的各量都大。总硒含量一直随Na2SeO3添加量增大而增大，但在Na2SeO3浓度大于100μg·mL－1时，菌丝干生物量明显减小，发酵液稍显浑浊，菌丝生长受到抑制，有机硒化率也开始降低。所以 90μg·mL－1为最佳添加量。

3.4 发酵液添加不同浓度Na2SeO3对香菇菌3种胞外酶活性影响

从图2可以看出，发酵液中添加浓度为60～90μg·mL－1的Na2SeO3，对淀粉酶、羧甲基纤维素酶、漆酶的活性起都起促进作用;当Na2SeO3浓度超过100μg·mL－1时三种酶活性被抑制，小于对照组;在Na2SeO3浓度60～90μg·mL－1三种酶活性先是随浓度增高而增大，但当在Na2SeO3浓度超过一定范围时，对三种酶的活性随浓度增大而降低。其中，Na2SeO3为 90μg·mL－1时，淀粉酶活性最大为 14.7U;Na2SeO3为 80μg·mL－1时，羧甲基纤维素酶活性为18.7U;Na2SeO3为90μg·mL－1时，漆酶活性最大为0.44U。

4 结论

图2 香菇菌液体发酵液中添加不同浓度Na2SeO3对3种胞外酶活性影响

通过实验可以确定90μg·mL－1的Na2SeO3为最佳添加量，此时总硒含量、有机硒含量分别为183 μg·g－1、108.3 μg·g－1，有机化率为59.2%;此时淀粉酶、漆酶活性活性也达到最大，分别为14.7U、0.44U。综上可以看出硒元素能促进香菇菌生长发育，这可能与含硒元素酶的活性有关。硒在微生物中以含硒酶和硒蛋白的功能形式存在［17］，含硒的GPx(谷胱甘肽过氧化物酶)家族催化超氧化物还原，防止细胞膜的氧化损伤;含硒的硫氧还蛋白还原酶(TDR)为细胞生长和分化所必需;硒还以硒代半胱氨酸(Sec)形式存在于甲酸脱氢酶、甘氨酸还原酶、氢化酶等含硒酶的活性中心，并为酶催化活性所必需。香菇菌内硒元素含量增加，这些含硒酶活性都可能提高，由此促进了香菇菌的生长发育。

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