响应面法优化鸡腿菇菌丝体多糖的提取工艺

闫舒雅，董岳峰，任翔萍,李 娜

(山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006)

鸡腿菇(Coprinuscomatus)又名刺蘑菇，因其形如鸡腿而得名，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鬼伞科、鬼伞属，是一种营养丰富的食用菌[1-3]。药理研究表明，鸡腿菇多糖是其重要的生物活性成分，在小鼠体内具有降低血糖值、提高机体免疫功能、抑制肿瘤生长、改善血液循环、抗疲劳等功效[4-7]，在体外具有抗氧化活性[8-11]。食用菌多糖目前主要是从食用菌子实体、发酵菌丝体中分离提取而得[12]。研究发现，液体发酵可以避免固体培养周期长、产量低、易污染等缺点[13-14]，通过液体发酵生产的鸡腿菇菌丝体在蛋白质、糖量、脂肪等营养成分上优于鸡腿菇子实体。鉴于此，作者通过单因素实验和响应面法对鸡腿菇菌丝体多糖的提取工艺进行优化，为鸡腿菇菌丝体多糖的工业化生产和开发应用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

鸡腿菇菌丝体，山西省康欣药业有限公司。

无水乙醇、葡萄糖、苯酚，分析纯，天津凯通化学试剂有限公司。

TU-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器厂；HH-6型数显恒温水浴锅，金坛荣华仪器制造有限公司；GZX-9076MBE型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵，巩义予华仪器有限责任公司。

1.2 鸡腿菇菌丝体多糖含量及提取率的测定

采用苯酚硫酸法[15-16]测定鸡腿菇菌丝体多糖含量，按下式计算鸡腿菇菌丝体多糖提取率：

1.3 鸡腿菇菌丝体多糖提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

分别考察浸提时间(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h)、浸提温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、浸提次数(1次、2次、3次、4次)对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响。

1.3.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，以鸡腿菇菌丝体多糖提取率为评价指标，以浸提时间、浸提温度、料液比为考察因素，采用Box-Behnken设计响应面实验，优化鸡腿菇菌丝体多糖的提取工艺。响应面实验的因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 浸提时间对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响

精确称取10 g鸡腿菇菌丝体，固定料液比为1∶20、浸提温度为90 ℃、浸提次数为2次，分别浸提0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h，考察浸提时间对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响，结果见图1。

从图1可以看出，随着浸提时间的延长，鸡腿菇菌丝体多糖提取率先升高后降低；当浸提时间为2 h时，提取率达到最高(6.4432%)。可能是由于，浸提时间延长，提取的多糖中杂质含量过多，导致提取率降低。因此，浸提时间以2 h较为适宜。

图1 浸提时间对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

2.1.2 浸提温度对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响

精确称取10 g鸡腿菇菌丝体，固定料液比为1∶20、浸提时间为2 h、浸提次数为2次，浸提温度分别为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，考察浸提温度对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响，结果见图2。

图2 浸提温度对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

从图2可以看出，随着浸提温度的升高，鸡腿菇菌丝体多糖提取率先升高后降低；当浸提温度为80 ℃时，提取率达到最高。可能是由于，浸提温度太高导致多糖结构被破坏，从而影响了提取率。因此，浸提温度以80 ℃较为适宜。

2.1.3 料液比对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响

精确称取10 g鸡腿菇菌丝体，固定浸提时间为2 h、浸提温度为90 ℃、浸提次数为2次，料液比分别1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，考察料液比对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响，结果见图3。

从图3可以看出，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，鸡腿菇菌丝体多糖提取率先升高后降低；当料液比为1∶20时，提取率达到最高。可能是由于，提取溶剂用量过多影响最后的醇沉效果，导致提取率降低。因此，料液比以1∶20较为适宜。

图3 料液比对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

2.1.4 浸提次数对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响

精确称取10 g鸡腿菇菌丝体，固定料液比为1∶20、浸提时间为2 h、浸提温度为90 ℃，分别提取1次、2次、3次、4次，考察浸提次数对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响，结果见图4。

图4 浸提次数对鸡腿菇菌丝体多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

从图4可以看出，随着浸提次数的增加，鸡腿菇菌丝体多糖提取率先升高后降低；当浸提次数为2次时，提取率达到最高，为4.2714%。因此，浸提次数以2次较为适宜。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 实验设计与结果

根据单因素实验结果，采用Box-Behnken设计响应面实验，结果见表2。

2.2.2 回归模型方程与方差分析

根据响应面实验结果，对表2数据进行二次回归拟合分析，得到二次多项回归模型方程：Y=7.93+0.23A-0.049B+0.15C+0.41AB-0.091AC-0.047BC-1.61A2-0.96B2-0.85C2。

回归模型方差分析见表3。

表2 响应面实验设计与结果

表3 方差分析

2.2.3 响应面交互作用分析

等高线的形状反映两因素交互作用的强弱，圆形代表不显著，椭圆形代表显著。浸提时间、浸提温度及料液比两两交互作用对鸡腿菇菌丝体多糖提取率影响的等高线图和响应面图见图5。

图5 各因素交互作用对鸡腿菇菌丝体多糖提取率影响的等高线图和响应面图Fig.5 Contour map and response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of polysaccharides from Copriuus comatus mycelium

从图5a可以看出，当料液比不变时，随着浸提时间的延长和浸提温度的升高，鸡腿菇菌丝体多糖提取率逐渐升高而后趋于稳定，浸提时间坡度增加的更加明显一些，说明浸提时间对提取率的影响更大，且等高线接近椭圆形，表明浸提时间和浸提温度的交互作用显著。从图5 b可以看出，当浸提温度不变时，随着浸提时间的延长和料液比的减小，鸡腿菇菌丝体多糖提取率先升高后降低，且等高线接近圆形，表明浸提时间和料液比的交互作用对提取率的影响不显著。从图5c可以看出，当浸提时间一定时，随着浸提温度的升高和料液比的减小，鸡腿菇菌丝体多糖提取率先升高后降低，且等高线呈椭圆形，表明浸提温度和料液比的交互作用对提取率影响显著。

2.2.4 最佳提取工艺的确定

由响应面法优化得到鸡腿菇菌丝体多糖的最佳提取工艺为：浸提时间2.08 h、浸提温度79.87 ℃、料液比1∶21。考虑实际操作，将最佳提取工艺调整为：浸提时间2 h、浸提温度80 ℃、料液比1∶20，在此条件下，鸡腿菇菌丝体多糖提取率为7.7980%，与模拟预测值7.9630%接近。证明该模型合理，优化的提取工艺切实可行，适用于鸡腿菇菌丝体多糖的提取。

3 结论

以鸡腿菇菌丝体多糖提取率为评价指标，采用单因素实验和响应面法优化鸡腿菇菌丝体多糖的提取工艺。确定最佳提取工艺为：浸提时间2 h、浸提温度80 ℃、料液比1∶20(g∶mL)，在此条件下，鸡腿菇菌丝体多糖提取率为7.7980%。