正交设计优选白洋淀芦根中阿魏酸的提取工艺

李洪　张静　王麟　王晓欣　高玉梅

【摘 要】目的：正交设计优选白洋淀芦根中阿魏酸甲醇回流法最佳提取工艺。方法：用正交实验法，以阿魏酸含量为考察指标，对甲醇浓度、回流次数、甲醇用量等影响因素进行研究，优选最佳提取工艺。结果：最佳工艺为加10倍量70%甲醇，回流提取2次，每次45分钟。结论：用该工艺提取效率高稳定性好，为从白洋淀芦根中提取阿魏酸提供了参考依据。

【关键词】阿魏酸；正交试验；白洋淀芦根；提取工艺

0 引言

芦根为禾本科植物芦苇新鲜或者干燥根茎[1]，它性寒、味甘，入肺、胃经，具有清热泻火、生津止渴、除烦、止呕、利尿之功效，临床常用于热病烦渴，肺热咳嗽，肺痈吐痰，胃热呕吐，热淋涩痛等症的治疗。芦根作为中国传统药物，在中医临床治疗中有着广泛的应用[2-3]。而白洋淀地区的芦苇资源丰富，自古就有“芦苇之乡，甲于河北”的美誉。该地区出产的芦根产量大、质量好，作为河北省特色药材，是北方地区芦根药材的重要来源之一。经查阅相关文献，发现目前关于芦根药材的质量控制研究较少，主要是以阿魏酸的高效液相含量测定和药材HPLC指纹图谱为主[4-6]，而关于白洋淀地区芦根的研究更是未见报道，缺乏白洋淀芦根相关的质量控制标准及方法。本研究通过以阿魏酸为指标，采用高效液相色谱（HPLC）法，观察不同提取时间、提取次数、溶剂用量及提取溶剂的浓度对白洋淀芦根中阿魏酸提取的影响，选取最佳提取工艺，为白洋淀芦根的质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪Agilent 1100（美国安捷伦科技有限公司）；CX-250型超声波清洗器（北京医疗设备二厂）；电热恒温水浴锅（天津中环实验电炉有限公司）；赛多利斯BS210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；乙醇浓度检测仪（河北省河间市宏利仪表厂）；白洋淀芦根（购自安国金康迪中药饮片厂）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为屈臣氏蒸馏水；阿魏酸（中国药品生物制品检定所，批号：110773-200813）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-水溶液（26：2：72）；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 考察因素选取

白洋淀芦根中主要活性成分阿魏酸易溶于甲醇[4]，因此确定甲醇为提取溶剂，以阿魏酸为检测指标，观察提取时间、提取次数、甲醇用量（相对于药材质量）及甲醇浓度为考察因素，每个因素设定3个水平层次（见表1），采用4因素3水平8次[L9（34）]正交试验进行研究测定。

表1 相关因素的3个水平层次划分表

1.2.3 供试品溶液制备

按处方比例分别称取5种中药材，放入具塞锥形瓶中，精密称重，分别用规定浓度的甲醇按照正交设计进行超声提取9次，放凉，再用同等浓度甲醇补足重量，定容，称重，合并提取液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，备用。

1.2.4 对照品溶液制备

精密称取阿魏酸对照品7.20mg，置100mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀；从中精密吸取5mL至10mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为阿魏酸对照品溶液。

1.2.5 标准曲线制备

精密吸取对照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL注入液相色谱仪，按1.2.1项色谱条件下记录色谱图，测定峰面值。以阿魏酸素峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标，做线性回归，得回归方程：Y=7.73×104X-1.84×104，r=0.999 9。结果表明，阿魏酸对照品在0.038-0.38μg的范围内进样量和峰面积与峰面积呈现良好的线性关系。

1.2.6 样品测定

精密吸取供试品溶液15 μL，注入高效液相色谱仪，按1.2.1项色谱条件下记录色谱图，测定其峰面积值。

2 结果及分析

2.1 L9（34）正交试验结果（见表2）

表2 L9（34）正交试验结果

表3 方差分析表

注：F0.05（2，2）= 19.00； F0.01（2，2）= 99.00

由表2、表3可见，以阿魏酸为指标，对白洋淀芦根中阿魏酸提取工艺因素影响大小是：A> D > B > C，A因素对提取工艺影响最大，即提取时间，B、C、D因素因素在实验水平上的影响无显著意义。正交实验结果显示，白洋淀芦根中阿魏酸的提取工艺最佳条件：A2 B2 C3 D2，即采用10倍药材量的70%乙醇，提取2次，每次45 min。

2.2 工艺验证

取白洋淀芦根适量，按照最佳工艺条件确定的提取时间、提取次数、乙醇用量及浓度，平行试验测定3组（见表4）。

表4 工艺验证

由表4可见，本方法检验结果稳定可靠。

3 讨论

本研究选取阿魏酸为测定白洋淀芦根的观测指标，采用HPLC法检测，以甲醇为提取试剂。取适量阿魏酸对照品，加甲醇制成溶液，用紫外分光光度计扫描，结果在320 nm处有最大吸收，参考2010年版《中华人民共和国药典》，确定检测波长是320 nm。经L9（34）正交试验得出影响白洋淀芦根中阿魏酸提取工艺的因素：提取时间>提取次数>乙醇用量>乙醇浓度，提取时间因素对提取工艺影响最大。冠心2号冻干粉针剂最佳提取工艺条件为：用药材10倍量75%的乙醇，提取2次，每次45min。本方法简便易行，准确可靠，可用于白洋淀芦根的质量控制与检测。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：152-153.

[2]曾立昆.大剂干芦根治疗肺脓疡[J].浙江中医杂志，1995（2）：87.

[3]张福生，陈学玉.芦根冲剂防治感冒效果观察[J].长治医学院学报，1994，5（1）：86-87.

[4]陈纯，康志英.不同产地芦根hplc指纹图谱研究[J].湖南中医杂志，2008，24（4）： 102-103.

[5]代雪平，宋汉敏，李振国.Hplc法测定不同产地芦根中阿魏酸的含量[J].中医研究，2010，23（9）：26-27.

[6]曾志，张艳萍，李核等.芦根液相色谱指纹图谱研究[J].中成药，2005，27（4）：373-377.

[责任编辑：杨玉洁]