脑蛋白水解物对小鼠记忆巩固能力的影响及机制

2016-01-08 12:39魏婧,马玉玲,邵晓彤
中国老年学杂志 2015年9期
关键词:亚硝酸钠

脑蛋白水解物对小鼠记忆巩固能力的影响及机制

魏婧马玉玲邵晓彤宋丹丹王广红陈丽娜安丽萍杜培革

(北华大学药学院,吉林吉林132013)

摘要〔〕目的观察脑蛋白水解物对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆能力的影响,探讨其可能的作用机制。方法采用跳台法观察脑蛋白水解物对亚硝酸钠记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆能力的影响,测定小鼠血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性与脑组织乙酰胆碱酯酶(AChE)、Na+-K+-ATP、γ氨基丁酸酯(GABA)、MDA含量和SOD活性,并观察小鼠脑组织海马区病理形态学变化。结果脑蛋白水解物能延长小鼠潜伏期,减少错误次数;降低血清MDA含量,升高血清SOD活性;降低脑组织Na+-K+-ATP和AChE含量,升高GABA含量;脑蛋白水解物对正常小鼠脑组织形态学无明显影响,对记忆巩固障碍模型小鼠脑组织有不同程度的修复作用。结论脑蛋白水解物能增强正常小鼠、改善亚硝酸钠记忆巩固障碍模型小鼠的学习记忆能力,可能与其减少自由基损伤有关。

关键词〔〕脑蛋白水解物;记忆巩固;亚硝酸钠

中图分类号〔〕R96〔文献标识码〕A〔

基金项目:吉林省卫生计生科研计划项目(20142088);吉林省生物大分子功能开发与应用工程实验室自主创新能力建设项目

通讯作者:杜培革(1963-),女,教授,主要从事生物大分子功能开发与应用方向研究。

第一作者:魏婧(1989-),女,硕士,主要从事生物大分子功能开发与应用方向研究。

脑蛋白水解物是猪脑组织的提取物,含神经营养因子、分子肽、氨基酸等活性成分〔1〕。研究表明,脑蛋白水解物易跨越血脑屏障,参与体内氧化,增加脑活性〔2〕;作用于中枢神经系统,保护神经细胞免受缺血、低氧、神经毒素等损害〔3~6〕。目前,脑蛋白水解物片剂、注射液等治疗阿尔茨海默病(AD)、急性脑出血所致的神经功能障碍取得了良好疗效〔7~9〕,但少有提高和改善学习记忆力的研究。记忆巩固是贮存大脑记忆痕迹使记忆加深,最后贮存于脑的过程〔8〕,是学习记忆的重要过程。本文旨在研究脑蛋白水解物对亚硝酸钠所致记忆巩固障碍小鼠的影响。

1材料与方法

1.1实验动物ICR小鼠140只,雄性,体重(18±2)g,吉林大学实验动物中心提供。

1.2脑蛋白水解物取新鲜猪脑,匀浆,胃蛋白酶酶解,取上清液经超滤、纳滤除杂后喷雾干燥,即得。

1.3试剂与仪器吡拉西坦(东北制药集团沈阳第一制药有限公司,批号:20120804),亚硝酸钠(沈阳市华东试剂厂,批号:20120901),乙酰胆碱酯酶(AChE)测定试剂盒、γ-氨基丁酸酯(GABA)测定试剂盒、Na+-K+-ATP酶测定试剂盒(上海尚乐生物制品研究所),丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物制品研究所,批号:20140109)。

电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,AL204),恒温生化培养箱(上海博远实业有限公司医疗设备厂,SPX-250B-Z),低温高速离心机(美国Eppendorf Centrifuge公司,5430R),手提式高速分离器(宁波新芝生物科技股份有限公司S10);紫外可见分光光度计(岛津国际贸易有限公司UV-2550),恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂),DT-200小鼠跳台测试箱(成都泰盟科技有限公司),酶标仪(TECAN Infinite M200)。

1.4动物分组实验动物分为正常+对照组(NC)(予蒸馏水0.2 ml/d)、正常+阳性药组(NP)(予吡拉西坦540 mg·kg-1·d-1)、正常+脑蛋白高剂量组(NH)(予脑蛋白水解物210 mg·kg-1·d-1)、正常+脑蛋白中剂量组(NM)(予脑蛋白水解物105 mg·kg-1·d-1)、正常+脑蛋白低剂量组(NL)(予脑蛋白水解物52.5 mg·kg-1·d-1);模型组(M)(予蒸馏水0.2 ml/d)、模型+阳性药组(MP)(予吡拉西坦540 mg·kg-1·d-1)、模型+脑蛋白高剂量组(MH)(予脑蛋白水解物210 mg·kg-1·d-1)、模型+脑蛋白中剂量组(MM)(予脑蛋白水解物105 mg·kg-1·d-1)、模型+脑蛋白低剂量组(ML)(予脑蛋白水解物52.5 mg·kg-1·d-1)。每组14只,分笼饲养,各组小鼠连续灌胃给药35 d,给药期间自由摄食和饮水,保持正常昼夜循环。

1.5跳台实验〔9〕实验共2 d,第1天为学习阶段,第2天为测试阶段。学习阶段将小鼠放入反应箱内适应环境3 min,通32 V交流电,记录5 min内跳下平台的错误次数作为学习成绩。除正常组外,模型组小鼠立即腹腔注射亚硝酸钠溶液120 mg/kg。24 h后进行重复跳台实验,记录潜伏期和错误次数,作为小鼠测试成绩。

1.6生化指标检测

1.6.1血清指标检测小鼠眼球取血,置于4℃离心机中5 000 r/min离心10 min,取血清,-20℃储存,备用。小鼠血清MDA含量和SOD活性检测步骤参照试剂盒说明书,采用紫外可见分光光度计进行检测。

1.6.2脑组织指标检测称取小鼠全脑组织,置于匀浆器中,加入9倍体积的生理盐水,在冰水浴中用手提式匀浆器研磨充分,4℃ 3 500 r/min离心10 min,取上清液,-20℃储存,采用BCA蛋白检测试剂盒测定小鼠脑组织蛋白含量。检测步骤参照试剂盒说明书。

1.7小鼠脑组织病理形态学检测(HE染色)将脑组织用乙醇、二甲苯脱水后,按常规方法用石蜡包埋,制成蜡块。蜡块经切片机切成5 μm的薄片,捞片,置于60℃烘箱中15 min烘干。将石蜡切片经二甲苯、乙醇脱蜡后自来水冲洗5 min,再用蒸馏水浸湿;在苏木素中染色2~3 min,自来水冲洗;放入盐酸酒精中分色5 min,自来水冲洗10 min;放入伊红中染色2 min,自来水冲洗;切片乙醇、二甲苯脱水后,中性树胶封片。

1.8统计学处理采用SPSS16.0软件行t检验。

2结果

2.1脑蛋白水解物对小鼠学习记忆巩固能力的影响与NC组比较,NH、NM和NL组第1天错误次数无显著性差异,NH和NM组第2天潜伏期明显延长(P<0.05),错误次数明显减少(P<0.05);NL组第2天潜伏期有延长的趋势,错误次数有增加的趋势,但无统计学意义,与NC组小鼠比较,M、MH、MM、ML和MP组小鼠第1天错误次数均无显著性差异;与M组小鼠比较,MH和MM组小鼠第2天潜伏期明显延长(P<0.05),错误次数明显减少(P<0.05);ML组小鼠无显著性差异,见表1。

组别第1天错误次数第2天潜伏期(s)第2天错误次数NC组4.79±2.7840.57±27.633.86±1.29NP组3.93±2.0983.64±75.012.64±1.98NH组4.57±2.44131.64±89.031)2.71±2.021)NM组4.64±2.31149.36±101.171)1.43±1.091)NL组5.07±1.3897.36±87.633.29±1.98M7.43±2.7717.43±10.878.36±2.84MP4.79±2.331)16.21±9.568.36±2.79MH5.29±3.2057.71±110.011)5.14±3.821)MM4.36±1.8636.14±20.462)4.00±2.151)ML6.71±5.3410.43±12.469.79±7.59

与NC组比较:1)P<0.05;与M组比较:2)P<0.05;下表同

2.2脑蛋白水解物对小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响与NC组小鼠比较,NH组小鼠血清中SOD活性升高,但无统计学意义;NM和NL组小鼠血清中SOD活性明显升高(P<0.05),M、MH、MM、ML和MP组小鼠血清中SOD活性均明显升高(P<0.05);各组MDA含量无明显变化,见表2。

与NC组小鼠比较,NH、NM和NL组小鼠脑组织中SOD活力均有降低的趋势,但无统计学意义;MDA含量均无明显变化,见表2。

组别SOD(U/mgprot)MDA(μmol/mgprot)NC100.81±15.975.35±1.10NP122.16±10.451)5.17±1.30NH113.81±19.045.33±0.96NM124.13±16.361)5.04±1.18NL121.34±16.131)5.55±1.12M170.83±10.821)3.24±2.18MP171.75±3.371)10.97±23.06MH163.57±10.351)6.03±6.12MM165.54±11.421)2.91±1.40ML161.99±11.651)14.46±10.93

2.3脑蛋白水解物对小鼠脑组织中GABA、Na+-K+-ATP、MDA、AChE含量及SOD活性的影响与NC组小鼠比较,M组小鼠脑组织中Na+-K+-ATP、GABA含量和SOD活性均有明显降低(P<0.05),MDA、AChE含量均明显升高(P<0.05);MH组小鼠脑组织中AChE含量和SOD活性均明显降低(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05),Na+-K+-ATP含量有降低的趋势、GABA含量有升高的趋势,但无统计学意义;MM组小鼠脑组织中Na+-K+-ATP、AChE含量明显降低(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05),GABA含量有升高趋势,SOD活性有降低趋势,但无统计学意义;ML组小鼠脑组织中Na+-K+-ATP、AChE含量明显降低(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05),GABA含量有升高趋势,SOD活性有降低的趋势,但无统计学意义;与M组小鼠比较,MH、MM和ML组小鼠脑组织中Na+-K+-ATP、GABA含量均明显升高(P<0.05),AChE含量明显降低(P<0.05);MH、MM和ML组小鼠脑组织中MDA含量均有降低的趋势,但无统计学意义;MH组小鼠脑组织中SOD活性有降低的趋势,MM和ML组小鼠脑组织中SOD活性有升高的趋势,但均无统计学意义,见表3,表4。

组别GABA(ng/ml)Na+-K+-ATP(μmolpi/mgprot)SOD(U/mgprot)MDA(μmol/mgprot)AChE(U/mgprot)NC1.51±0.091.72±0.09119.72±16.377.84±1.001.37±0.10NP1.57±0.171.57±0.14116.97±12.738.25±0.951.43±0.12NH1.85±0.101)1.72±0.15105.86±27.847.64±1.211.16±0.191)NM1.78±0.121)1.63±0.18116.15±26.468.43±1.741.25±0.10NL1.84±0.091)1.56±0.35102.98±33.038.95±1.201.26±0.08

组别Na+-K+-ATP(μmolpi/mgprot)MDA(μmol/mgprot)GABA(ng/ml)AChE(U/mgprot)SOD(U/mgprot)M1.17±0.171)11.50±1.571)1.27±0.161)1.51±0.101)60.14±38.471)MP1.25±0.151)8.91±1.382)1.25±0.041)1.03±0.181)84.12±54.93MH1.55±0.152)10.62±1.601)1.64±0.152)1.13±0.081)2)22.92±14.461)MM1.51±0.151)2)10.97±1.161)1.62±0.202)1.15±0.081)2)89.46±33.22ML1.51±0.371)2)11.01±1.871)1.63±0.162)1.16±0.091)2)87.27±44.87

2.3小鼠脑组织病理形态学(HE染色)NC组小鼠脑组织海马区细胞总体染色较浅,细胞层次和界限清楚,排列整齐,染色质均匀,胞质丰富,细胞形态结构清晰完整。NP组小鼠脑组织海马区椎体细胞排列较整齐,细胞未出现空泡变性,未见细胞坏死;NH组小鼠脑组织海马区锥体细胞排列整齐,细胞未出现空泡变性,未见细胞坏死;NM组小鼠脑组织海马区锥体细胞排列尚整齐,鲜见细胞空泡变性及坏死;NL组小鼠脑组织海马区锥体细胞排列比较整齐,少量细胞出现空泡变性及坏死。

M组小鼠脑组织海马区染色较深,细胞胞体边界因染色深而更加清晰,神经细胞明显减少,细胞排列较正常对照组散乱,游离细胞增加,结构模糊或消失,部分细胞有空泡变性,胶质细胞增生;MP组小鼠脑组织海马区较正常阳性药组小鼠脑组织海马区椎体细胞排列紊乱,部分细胞出现空泡变性;MH组小鼠脑组织海马区锥体细胞排列较正常高剂量组小鼠紊乱,部分细胞出现空泡变性及坏死;MM组小鼠脑组织海马区锥体细胞较正常中剂量组小鼠排列紊乱,部分细胞出现空泡变性及坏死;ML组小鼠脑组织海马区锥体细胞较正常低剂量组小鼠排列紊乱,颜色变深,细胞出现空泡变性及坏死。见图1。

图1 各组小鼠脑组织病理学形态变化

3讨论

记忆障碍模型是评价药物对记忆过程影响的有效手段。亚硝酸钠是一种致缺氧剂,大量亚硝酸盐进入机体,可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白,失去携氧能力,引起组织缺氧,进而引起脑内GABA、多巴胺及氨基酸类等神经递质浓度失衡,脑内乙酰胆碱的合成和释放降低,神经元可塑性改变及神经细胞坏死,引起动物记忆巩固障碍〔10〕。

乙酰胆碱是参与脑内多种与学习记忆相关活动的重要神经递质,其脑内含量是衡量机体学习记忆能力的重要指标之一,所以,作为能水解乙酰胆碱的AChE也是衡量机体胆碱能神经系统活性的指标〔11,12〕。本研究中,脑蛋白水解物在小鼠体内可以减少AChE的生成,通过减少水解乙酰胆碱来提高机体胆碱能神经系统的活性。

Na+-K+-ATP酶主要分布在细胞膜上,是维持细胞正常结构功能和细胞膜内外离子平衡的重要保障。有研究结果显示,脑内的离子流紊乱导致脑内供氧缺乏、细胞衰老、脑组织损伤、学习记忆障碍的重要原因〔13〕。本实验中,脑蛋白水解物在小鼠体内可调节Na+-K+-ATP酶含量,维持离子平衡,改善脑供氧不足。SOD和GABA是体内抗氧化的重要组成成分,能清除体内的活性氧自由基、过氧化氢和脂质过氧化物,保护细胞膜免受自由基的过氧化损伤。因此,测定主要过氧化反应代谢产物的MDA和过氧化防御体系中重要的SOD和GABA的含量均可以反映机体的自由基代谢水平。本实验中,脑蛋白水解物可明显提高正常小鼠SOD活力,减少MDA的生成,具有明显的抗氧化能力。表明脑蛋白水解物可通过抗氧化,抑制AChE等途径改善学习记忆能力,为临床治疗相关疾病提供科学依据。

海马区、大脑皮层的颞叶下部、丘脑和边缘系统等都与学习和记忆功能相关,其中,海马区和大脑皮层尤其重要。本文病理学结果表明,脑蛋白水解物对小鼠海马区锥体细胞有修复作用,间接提高了小鼠学习记忆能力。

本实验从行为学和分子水平两个方面研究脑蛋白水解物对正常小鼠和记忆巩固障碍模型小鼠的影响。结果可知,脑蛋白水解物能延长小鼠潜伏期,减少错误次数;降低小鼠血清MDA含量,升高血清SOD活性;降低小鼠脑组织中Na+-K+-ATP和AChE含量,升高GABA含量,表明脑蛋白水解物对正常小鼠脑组织及形态学无明显影响,对记记忆巩固障碍模型小鼠脑组织有不同程度的修复作用。但学习记忆能力是记忆获得、记忆巩固和记忆再现的综合过程,脑蛋白水解物增强和改善学习记忆力的作用是否与其他过程有关,有待进一步研究。

4参考文献

1Bespalova MA,Kliaich K,Maksimova SP,etal.The characteristics of the brain cerebrosides,sulfocerebrosides and gangliosides in experimental demyelination and cerebrolysin administration〔J〕.Nerv Sist,1991;30(1):64-71.

2王广玉.脑活素治疗新生儿缺氧血性脑病〔J〕.新药与临床,1995;14(2):123.

3Zuer VL.The effect of cerebrolysin on the metabolism of brainphosoholipiels in growing animals with experimental demylination〔J〕.Nerv Sist,1991;30(1):85-8.

4张道东,王秀英.脑蛋白水解物注射液治疗阿尔茨海默病的临床研究〔J〕.中国药业,2006;15(15):27-8.

5刘夕芝.脑蛋白水解物纳洛酮抢救一氧化碳中毒40例分析〔J〕.中华当代医学,2006;4(1):69-70.

6龙洁,魏岗之,徐忠宝,等.脑蛋白水解物注射液与脑活素治疗脑血管疾病的比较〔J〕.新药与临床,1996;15(6):325-8.

7叶良成,毛树洲.脑蛋白水解物的药理作用与临床应用研究进展〔J〕.医药导报,2008;(1):72-3.

8马山,侯林,李慧芬,等.醒脑益智胶囊对记忆障碍小鼠学习功能的影响〔J〕.山东中医药大学学报,2014;38(4):370-2.

9Kwon YT,Balogh SA,Davydov IV,etal.Altered activity,social behavior,and spatial memory in mice lacking the NTAN pamidase and the asparagine branch of the,N-end rule pathway〔J〕.Mol Cell Biol,2000;20(11):4135-48.

10程玥,热依罕古丽·萨塔尔,张雪,等.七福饮对亚硝酸钠致小鼠学习记忆障碍的影响〔J〕.陕西中医,2014;35(9):1257-8.

11郁志华,林水淼,陈久林.心气虚证模型大鼠学习记忆和脑内胆碱能系统变化〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(19):2782-4.

12王琦.血管性痴呆与中枢胆碱能系统〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(24):3833-5.

13范红艳,顾饶胜,王艳春,等.大豆异黄酮抗衰老作用研究〔J〕.中草药,2010;41(12):2054-7.

〔2014-05-17修回〕

(编辑李相军)

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