通补消积饮对人肺腺癌A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响

通补消积饮对人肺腺癌A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响

李义君1，全丽娜2，刘建秋3

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001；2.哈尔滨医科大学附属第三医院，哈尔滨 150040；

3.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040)

摘要：目的研究通补消积饮对A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响。方法应用Western-blot法观察通补消积饮对A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响。结果通补消积饮低、中、高剂量组含药血清作用A549细胞48 h后,Cyclin D1蛋白相对表达量分别为(0.739±0.051),(0.520±0.047)，(0.395±0.035)，通补消积饮各剂量组与空白血清组(0.881±0.062)比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，在一定的时间内表现出明显的量-效关系。结论通补消积饮能明显抑制A549细胞Cyclin D1蛋白的表达。

关键词：通补消积饮；A549；Cyclin D1

DOI::10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.06.027

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)06-0617-02

基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521509)。

作者简介:李义君(1979-)，男，医学博士，主治医师，主要从事中医药治疗恶性肿瘤的临床与实验研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-09-24)

Tongbu Xiaoji decoction on expression of Cyclin D1 in human lung adenocarcinoma cell line A549

LI Yijun1,QUAN Lina2,LIU Jianqiu3

(1.Heilongjiang University Second Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150001,China;

2.The Third Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150040,China;

3.Heilongjiang University First Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of the Tongbu-Xiaoji decoction to the expression of Cyclin D1 of A549 cells.MethodsThe protein expression of Cyclin D1 in A549 cells were evaluated by Western blot.ResultsTongbu-Xiaoji decoction with low、median and high dose medicated serum were used to affected A549 cell.After 48 h,the protein expression of Cyclin D1 of A549 cells significantly decreased and the values were (0.739±0.051),(0.520±0.047) and (0.395±0.035).Compared with that of blank group,Tongbu-Xiaoji decoction with low,median and high dose medicated serum (0.881±0.062) had a significant difference (P<0.05,P<0.01),and the affection shows a dose-dependent manner.ConclusionTongbu Xiaoji decoction inhibited the protein expression of Cyclin D1 in A549 cells significantly.

Keywords:Tongbu Xiaoji decoction;A549;Cyclin D1

中医药在中晚期肺腺癌的治疗上有其独特理念和实际优势[1]。通补消积饮是多年临证中总结的经验方，笔者研究通补消积饮对A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响，总结报道如下。

1实验材料

人肺腺癌A549细胞，Wistar雄性大鼠。二氧化碳孵育箱；医用超净工作台；高速台式离心机；低速离心机；电热恒温水槽；电泳仪；垂直电泳槽及制胶装置；酶标仪。通补消积饮中药复方由黑龙江中医药大学附属二院饮片药局提供。RIPA裂解液；Bradford法蛋白定量试剂盒；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)；ECL试剂盒；Beta Actin antibody；Cyclin D1 antibody。

2实验方法

2.1含药血清制备Wistar雄性大鼠16只随机分为4组，每组4只。通补消积饮低、中、高剂量组给药剂量分别为28，56，112 g/(kg·d)，分2次灌胃;空白血清组：灌生理盐水，分2次灌胃；连续给药5 d，第5天灌服1 d剂量2 h后将大鼠麻醉，心脏穿刺采血取含药血清，过滤除菌，冰箱保存备用。

2.2Western-blot法检测通补消积饮对A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响

2.2.1蛋白的提取将A549细胞接种于培养瓶中，加入各组血清作用48 h后收集细胞,加入适量细胞裂解液充分混匀，充分裂解后离心5 min，取上清。

2.2.2Bradford法进行蛋白定量用Bradford 染色液测定样品吸收值A595，根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

2.2.3Western-blot分析1)SDS-PAGE电泳；2)转膜；3)封闭；4)孵育抗体；5)显色；6)应用ImageJ图像分析软件对Western-blot图片进行灰度分析。

3实验结果

从结果分析以及Western-blot图片(图1)中可以看出，通补消积饮含药血清作用A549细胞48 h后，Cyclin D1蛋白表达明显降低，且随着剂量的增加，Cyclin D1蛋白表达逐渐下调。各组Cyclin D1蛋白相对表达量分别为空白血清组(0.881±0.062)，通补消积饮低剂量组(0.739±0.051)，中剂量组(0.520±0.047)，高剂量组(0.395±0.035)。通补消积饮各剂量组与空白血清组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，并表现出明显剂量依赖性。

A：空白血清组　B：通补消积饮低剂量组　C：通补消积饮中剂量组　D：通补消积饮高剂量组 图1　通补消积饮含药血清作用A549细胞48 h后Cyclin D1蛋白表达结果

4讨论

细胞周期素D1(Cyclin D1)是重要的细胞周期调节蛋白,在细胞周期的正常调控中起着关键作用。Cyclin D1是G1期细胞周期素，其与细胞周期依赖性激酶4(CDK4)或细胞周期依赖性激酶6(CDK6)结合呈复合物,激活CDK4的蛋白激酶活性，促使Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白释放出与之结合的转录因子E2F，导致DNA合成，促进细胞由G1期进入S期[2]。因此，如果Cyclin D1发生过度表达，引起细胞增殖的周期失调，细胞过度增殖导致肿瘤发生。Cyclin D1基因结构及表达异常常见于肺腺癌和鳞癌[3]。研究证实[4-8]，Cyclin D1在非小细胞肺癌组织中存在过度表达。

中晚期非小细胞肺癌的主要证型是气阴两虚型[9-10]。气阴两虚贯穿于肺癌的始终，与肺脏的生理特性有密切相关[11]。通补消积饮由生晒参、麦冬、黄芪、北沙参、全瓜蒌、贝母、薏苡仁、白术、半夏、陈皮、半枝莲、白花蛇舌草、山慈菇、蚤休、大黄、莪术、甘草，共17味药物组成。通补消积饮是针对中晚期肺腺癌病人以气阴两虚为主兼痰、瘀、毒结的病因病机而拟定的经验方。实验结果表明，通补消积饮能明显下调A549细胞中Cyclin D1蛋白表达。通补消积饮对A549细胞抑制增殖的可能机制是：通补消积饮能明显降低Cyclin D1蛋白在A549细胞中的表达，减少Cyclin D1蛋白与CDK4或CDK6的结合，从而抑制CDK4的蛋白激酶活性和Rb蛋白的磷酸化，使DNA的合成受阻，最终表现为对A549细胞的增殖抑制，实现其治疗肺癌的目的。

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