枯草芽孢杆菌B10对肉鸡免疫、抗氧化功能及血清生化指标的影响

■王佰魁 姚江涛 卞国顺 毛予龙 俞国乔 李卫芬

（1.浙江大学动物科学学院饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室，浙江杭州 310029；2.上海新农饲料股份有限公司，上海 201613；3.浙江省畜牧技术推广总站，浙江杭州 310020）

兽用抗生素的应用推动了畜牧业的迅速发展，正确使用抗生素不仅能够促进动物生长，提高动物生产性能，同时作为药物在畜禽疾病预防与治疗、改善动物畜产品品质等方面发挥着积极的作用。但是，随着抗生素的广泛滥用，产生了诸多副作用：如细菌或病毒耐药性、畜禽肉制品中药物残留、肠道菌群失衡引起的二次感染等[1]。因此，寻找安全高效、环境友好型生物饲料添加剂以替代抗生素已成为人们研究热点。研究表明，枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶和抗菌物质，在调节肠道免疫功能、改善肠道微生物结构、促进肠道营养物质吸收、抑制肠道致病菌生长和提高动物生产性能等方面具有明显的积极作用，在畜禽养殖中是一种理想的生物饲料安全添加剂[2-3]。张红兵等[4]研究发现，枯草芽孢杆菌可有效替代抗生素改善肉鸡生长性能。本实验室前期研究表明，日粮中添加枯草芽孢杆菌B10制剂对肉鸡的生长性能的影响与抗生素相近，提示芽孢杆菌可作为抗生素替代品用于肉鸡生产，本论文进一步研究了其对岭南黄肉鸡免疫和抗氧化功能的影响，旨在初步探明枯草芽孢杆菌B10替代抗生素应用于肉鸡养殖的机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌B10制剂：由浙江大学饲料科学研究所微生物与基因工程实验室制备，活菌数为1.0×108CFU/g。

抗生素：林可霉素购自天津艾森生物工程有限公司。

试验动物及饲粮：岭南黄肉鸡购自嘉兴星健禽业养殖有限公司，饲养试验于浙江一星实业股份有限公司养殖试验鸡场进行。试验基础饲粮组成与营养水平参照NRC（1994）[5]中营养标准，由浙江一星实业股份有限公司生产加工成粉状全价饲料，原料组成及营养水平见表1，未添加任何抗生素。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.2 试验设计

试验选取18日龄健康且体重无显著差异（P＞0.05）的健康岭南黄肉鸡300羽，随机分为2个试验组，每个试验组5个重复，每个重复30羽。在基础饲粮的基础上，对照组添加林可霉素4.4 mg/kg，B10组添加枯草芽孢杆菌B10制剂1 000 mg/kg，试验期为40 d，饲喂至57日龄结束。

1.3 饲养管理

试验开始前一周按常规消毒程序对鸡舍进行消毒。试验鸡群采用地面垫料平养，自然光照辅以人工照明，采取自由采食和饮水方式。按常规免疫程序对试验鸡群进行新城疫及法氏囊疫苗免疫接种。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 样品采集与处理

饲养试验结束后，禁食（不禁水）12 h后从每重复中随机抽取3只体重相近的鸡称重。血清样品采集：采用翅静脉采血，用血液促凝试管采血后于37℃水浴中静置，待析出血清后于4℃、3 000 r/min离心15 min，取其上清液分装于1.5 ml Eppendorf管中，-20℃低温冰箱中保存，以备血清生化指标分析检测用。肝脏组织制备：称取一定质量肝脏组织，加9倍质量的生理盐水做10倍稀释，用匀浆器冰上匀浆，4℃、2 000 r/min离心15 min，取上清备用。空肠粘膜制备：将空肠内容物挤干净，纵向剖开后刮取内层黏膜，称取0.5 g黏膜样品加9倍质量的生理盐水做10倍稀释，用匀浆器冰上匀浆，4℃、2 000 r/min离心15 min，取上清备用。

1.4.2 肝脏和空肠黏膜免疫相关细胞因子测定

肝脏和空肠粘膜细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、干扰素-α（IFN-α）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、转化生长因子-β（TGF-β）、β-防御素（β-DF）水平均采用美国R＆D公司生产的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行检测。

1.4.3 肝脏抗氧化指标

肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）水平均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。

1.4.4 血清生化指标

血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、尿酸（UA）含量测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，球蛋白（GLB）试剂盒购于宁波慈城生化试剂厂。

1.5 数据统计与处理

试验数据采用SPSS 16.0统计软件中独立样本t检验进行统计分析处理，试验数据以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示为差异显著。

2 结果

2.1 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡肠黏膜免疫功能的影响

表2 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡空肠黏膜免疫功能的影响

由表2可知，B10组肉鸡空肠粘膜IL-6、IL-12、IFN-α、IL-10、TGF-β及sIgA水平显著高于抗生素对照组，分别提高了163.39%、59.72%、121.46%、267.52%、211.74%及60.52%（P＜0.05）；两组间TNF-α、IFN-γ、IL-17、β-D水平差异不显著（P＞0.05）。

2.2 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡肝脏抗氧化功能的影响

表3 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡肝脏抗氧化功能的影响

由表3可知，与抗生素对照组相比，B10组肉鸡肝脏SOD酶活性显著降低了19.49%（P＜0.05），而T-AOC、GSH-Px、CAT活性及MDA水平虽有所降低，但差异却均不显著（P＞0.05），两组间GSH水平无显著影响（P＞0.05）。

2.3 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡肝脏细胞因子含量的影响(见表4)

表4 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡肝脏免疫相关细胞因子表达的影响

由表4可知，B10组肉鸡肝脏IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β、IFN-α及IFN-γ水平与抗生素对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.4 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡血清生化指标的影响

表5 枯草芽孢杆菌B10对肉鸡血清生化指标的影响

由表5可知，与抗生素组相比，B10组肉鸡血清中AKP和LDH活性分别显著提高了43.26%、21.04%（P＜0.05），而UA水平显著降低了22.87%（P＜0.05）；两组间TP、ALB和GLB含量有所提高，但差异均不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌B10对黄肉鸡免疫功能的影响

细胞因子是由免疫细胞和非免疫细胞分泌的一类具有免疫调节和效应功能的小分子蛋白质，在调节固有免疫和适应性免疫过程中发挥着极其重要的作用。IL-17通过刺激免疫细胞或非免疫细胞诱导其分泌TNF、IL-6、β防御素等炎症因子，进而募集并激活DC、T细胞、中性粒细胞等炎症细胞，从而增强机体抗病原菌感染能力[6]；IL-6、IL-10等可诱导、促进IgA的分泌；IL-12通过激活NK细胞和T细胞诱导其分泌大量的IFN-γ，IFN与TNF相互作用可增强TNF抗肿瘤效果[7]。分泌型免疫球蛋白（sIgA）作为肠粘膜表面的主要免疫球蛋白，在抑制病原微生物繁殖、中和毒素、保护肠道黏膜完整性等方面具有重要作用。据报道，若肠道内sIgA水平显著下降时将导致肠道菌群失衡，甚至致病菌易位而引发机体感染[8]。禽类β-防御素在抵御外来病原微生物及杀伤入侵病原菌中发挥重要作用。李卫芬等[7]研究报道，枯草芽孢杆菌制剂能够显著提高肉鸡盲肠和回肠黏膜中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平及回肠黏膜sIgA含量。本试验发现，与抗生素对照组相比，饲粮中添加枯草芽孢杆菌B10显著提高了肉鸡空肠粘膜免疫相关细胞因子IL-6、IL-12、IFN-α、IL-10、TGF-β水平及sIgA含量，而对肝脏免疫相关细胞因子水平无显著影响。说明与抗生素对照组相比，枯草芽孢杆菌B10主要是通过增强肉鸡肠道黏膜免疫功能来增强肉鸡抗感染能力。

3.2 枯草芽孢杆菌B10对黄肉鸡肝脏抗氧化功能的影响

T-AOC变化反映出机体的抗氧化水平、MAD含量变化可间接反映细胞氧化损伤程度，GSH-Px、GSH及CAT在清除自由基、抗氧化等方面发挥着重要作用。机体内SOD是生物体内重要的抗氧化酶，通过一系列催化反应将有害的超氧自由基转化为过氧化氢，产生的过氧化氢经体内过CAT催化降解为水。余东游等[9]研究报道，枯草芽孢杆菌可显著提高肉鸡肝脏T-AOC、GSH-Px、SOD及CAT活性，显著降低MDA水平。本试验研究发现，与抗生素对照组相比，枯草芽孢杆菌B10降低了肉鸡肝脏SOD活性显著，而对TAOC、GSH-Px活性、GSH及MDA含量无显著影响，这说明枯草芽孢杆菌B10可能会显著改善肉鸡的氧化应激状态，所以所需的抗氧化酶活性相对较低。

3.3 枯草芽孢杆菌B10对黄肉鸡血清生化指标的影响

碱性磷酸酶（AKP）主要来源于肝脏和骨骼，与肠道脂质转移及骨质钙化有关，是钙、磷代谢的重要指标。此外，AKP促进肠道营养物质吸收的同时，还能抵御致病菌对肠道黏膜的损伤[10]。乳酸脱氢酶（LDH）是糖酵解途径中重要的标志酶，存在于机体各组织器官中，在无氧酵解过程中催化丙酮酸转化为乳酸，产生ATP提供能量[11]。本研究发现，与抗生素对照组相比，枯草芽孢杆菌B10可显著提高肉鸡血清AKP和LDH活性，说明饲粮中添加枯草芽孢杆菌B10有利于改善肝脏物质和能量代谢，促进机体钙、磷吸收，这同前人研究报道相一致[12]。

血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）及球蛋白（GLB）水平是反映机体营养物质代谢的重要指标。血清中白蛋白是机体蛋白质营养需求的主要来源，其浓度变化是反映动物机体蛋白质营养摄入和代谢利用的主要指标之一[4]。血清中尿酸（UA）是禽类蛋白质代谢的主要产物，其含量变化可间接反映禽类对蛋白质、氨基酸等营养物质的利用情况，其含量越低说明含氮营养物质的利用率越高，体内蛋白质等营养物质的合成代谢越强[13]。本研究结果发现，枯草芽孢杆菌B10可显著降低血清UA含量，对TP、ALB和GLB含量无显著影响，说明饲粮中添加枯草芽孢杆菌B10在一定程度上有利于促进肉鸡机体对蛋白质及氨基酸等含氮营养物质的吸收和利用。

4 结论

饲粮中添加枯草芽孢杆菌B10可有效替代饲用抗生素，显著增强肉鸡肠黏膜免疫功能、改善肉鸡抗氧化应激状态、促进肉鸡机体对含氮营养物质的吸收和利用。