饲料中添加不同益生菌对虎龙斑生长、免疫力及抗氧化能力的影响

■黄 灵 李小梅 舒 琥 张海发 石和荣

（1.广州大学生命科学学院，广东广州 510006；2.广东省大亚湾水产试验中心，广东惠州 516081）

虎龙斑是由棕点石斑鱼（E.fuscoguttatus♀）和鞍带石斑鱼（E.lanceolatus♂）杂交的新品种，具有生长速度快、成活率高、体形美观、肉质鲜美等优良特性[1]。近年来，由于虎龙斑具有较好的养殖优势，在中国东南沿海地区越来越受到养殖户的喜爱，人工养殖得到了快速发展。然而，由于集约化、规模化养殖面积的扩大和养殖密度的增加，养殖石斑鱼的各种病害发生更加频繁，给养殖业带来了巨大的经济损失[2]。为了提高存活率，一些抗生素和化学药物会被用来预防细菌、真菌和寄生虫等疾病[3]。但是，抗生素和化学药物的滥用会导致鱼类肠道菌群失调、抗生素抗性、自身免疫力下降和严重食品安全等问题[4]。因此，迫切需要开发绿色无公害饲料、合理选用免疫增强剂等方式来提高石斑鱼的抗病力，减少抗生素和化学药物的使用。

益生菌制剂是一类有利于水产动物健康的微生物细胞或微生物细胞组成成分[5]。水产动物饲料中的益生菌制剂主要有乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母菌类和光合细菌等。研究发现，饲料中添加芽孢杆菌可以显著提高吉富罗非鱼（GIFT，Oreochromis niloticus）幼鱼的免疫力和抗氧化能力[6]，沈斌乾等[7]在饲料中添加芽孢杆菌能促进青鱼（Mylopharyngodon piceus）鱼种的生长和降低其饵料系数。王梦亮等[8]研究发现光合细菌促进了鲤鱼（Cyprinus carpio）肠道中益生菌的生长，提高了鲤鱼肠道消化酶活性。劳惠燕等[9]在饲料中添加光合细菌复合制剂持续饲喂草鱼（Ctenopharyngodon idellus）30 d和60 d，促进了草鱼的生长，提高了草鱼的非特异性免疫力。李小梅等[10]以一种由光合细菌、短小芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌组成的复合益生菌拌喂斜带石斑鱼（E.coioides）30 d，结果表明复合益生菌饲料可有效促进斜带石斑鱼的生长和体增重，显著提升斜带石斑鱼非特异性免疫功能。而目前还没有关于芽孢杆菌或光合细菌对虎龙斑幼鱼免疫和抗病力影响的相关研究报道。因此，本试验的目的是研究饲料中添加不同益生菌对虎龙斑免疫和抗病力的影响，为益生菌制剂在石斑鱼配合饲料中的使用和探索生态健康养殖技术提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用的虎龙斑由广东省大亚湾水产试验中心提供。试验饲料包括基础饲料、乳化鱼油包裹饲料（由2%饲料量的乳化鱼油包裹基础饲料）、益生菌饲料（益生菌饲料由基础饲料与不同用量的益生菌混匀，再以2%饲料用量的乳化鱼油包裹制得）。试验用的基础饲料由广东越群饲料公司提供，营养成分见表1。试验用的基础饲料由广东越群饲料公司提供，粗蛋白质含量为48.0%，粗脂肪含量为10.0%，粗纤维含量为3.0%，粗灰分含量为16.0%，水分含量为12%，钙含量为2.0%，总磷含量为1.8%。试验用的益生菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）制剂和光合细菌(Photosynthesis bacteria)制剂，芽孢杆菌制剂分别由地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）和短小芽孢杆菌（B.pumilus）按1∶1比例混合组成，光合细菌制剂是沼泽红假单胞菌，其中，地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和光合细菌的有效活菌数分别为1.0×109、2.0×109cfu/g和1.0×109cfu/g。

表1 试验基础饲料基本营养成分(%)

1.2 试验分组及饲养管理

选用540尾体重为（33.98±4.91）g、体长为（10.48±0.61）cm的虎龙斑，随机分为6个组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，分别放入18个网箱（1.0 m×1.0 m×1.0 m）内。分别在基础饲料中拌喂低浓度0.1%的芽孢杆菌、高浓度0.5%的芽孢杆菌、低浓度1%的光合细菌和高浓度5%的光合细菌，并以2%饲料用量的乳化鱼油包裹，配置成编号为Diet 1、Diet 2、Diet 3、Diet 4四种饲料作为添加组，再增设乳化鱼油组和对照组。

在整个试验期间，每20 d测量一次虎龙斑的体重，日投喂率为体质量的3%左右，日投喂量的多少是由上一次测量鱼的总重和其固定的投喂量率共同决定的。每天定量投喂2次，分别于8:30和16:30各投喂一次。整个试验期间水质如下：平均水温27～31 ℃，盐度25‰～30‰，pH值7.5～8.0，溶氧≧5 mg/l，氨氮≦0.04 mg/l。正式饲养60 d后，测定鱼的体重、体长，采集鱼的血液和肝脏。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能指标

试验结束，停食24 h后对试验鱼进行计数，测量体重、体长。分别按下面公式计算饲料系数、增重率、肥满度、肝体比指数、脏体比指数和成活率。

饲料系数=投喂量(g)/[末体重(g)-初体重(g)]；

增重率(%)={[末体重(g)-初体重(g)]/初体重}×100；

肥满度(g/cm3)=[末体重(g)/末体长3(cm3)]×100；

肝体比指数(%)=[肝脏重(g)/鱼体重(g)]×100；

脏体比指数(%)=[内脏重(g)/鱼体重(g)]×100；

成活率(%)=(收获尾数/放养尾数)×100。

1.3.2 血清免疫指标测定

采用穿刺尾动脉法取血，采集的血样置于4℃冰箱静置4 h，然后在4℃、5 000 r/min离心15 min，收集上层血清测定酶活性。血清碱性磷酸酶、血清总超氧化物歧化酶、血清溶菌酶酶活性和血清总蛋白浓度测定均按相应试剂盒（南京建成生物工程研究所）方法进行。

1.3.3 肝脏抗氧化指标的测定

准确称取肝脏重量，按重量（g）∶体积（ml）=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，然后在4℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液待测。肝脏上清液总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽、过氧化氢酶和丙二醛活性均采用南京建成生物工程研究所生产的相应试剂盒测定，操作步骤按照说明书进行。

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1.3.4 攻毒试验

饲喂结束后，用哈维氏弧菌活菌菌悬液（1×108cfu/ml）通过腹腔注射进行攻毒，每尾0.2 ml，然后置于干净的水族缸内继续饲养并观察10 d，饲养条件和注射前相同，每天多次观察和记录虎龙斑的发病和死亡情况，对死亡的虎龙斑进行解剖、细菌分离并确认死因。按照以下公式计算：

免疫保护率(%)=[1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100。

1.4 数据处理

各组数据均用SPSS17.0数据软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），若差异显著，则用Duncan's法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，统计结果数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑生长性能的影响（见表2）

表2 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑生长性能的影响

由表2可知，饲养60 d后，与对照组相比，乳化鱼油组的虎龙斑所有生长性能指标均无显著差异（P＞0.05）。与对照组和乳化鱼油组相比，Diet 2组和Diet 3组的末体重极显著增加（P＜0.01），其它各益生菌添加组虎龙斑的末体重均显著增加（P＜0.05），末体长各益生菌添加组都显著增加（P＜0.05）。与对照组和乳化鱼油组相比，Diet 2组和Diet 3组饲料系数极显著降低（P＜0.01），其它各益生菌添加组饲料系数都显著降低（P＜0.05），增重率Diet 2组和Diet 3组极显著增加（P＜0.01），其它各益生菌添加组增重率显著增加（P＜0.05）。末肝体比、末脏体比、肥满度和成活率均无显著差异（P＞0.05）。

2.2 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑血清免疫力的影响（见表3）

表3 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑血清免疫力的影响

由表3可知，与对照组相比，乳化鱼油组的虎龙斑血清总蛋白浓度、碱性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性都没有显著差异（P＞0.05）。与对照组和乳化鱼油组相比，各益生菌添加组的虎龙斑血清总蛋白浓度都显著升高（P＜0.05），碱性磷酸酶活性Diet 2组极显著升高（P＜0.01），其他各益生菌添加组显著升高（P＜0.05）。血清超氧化物歧化酶Diet 2组极显著高于对照组和乳化鱼油组（P＜0.01），其他各益生菌添加组跟对照组和乳化鱼油组没有显著差异（P＞0.05）。血清溶菌酶活性Diet 2组和Diet 3组显著高于对照组和乳化鱼油组（P＜0.05），Diet 1组和Diet 4组与对照组和乳化鱼油组没有显著差异（P＞0.05）。

2.3 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑肝脏抗氧化能力的影响（见表4）

表4 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑肝脏抗氧化能力的影响

2.4 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑攻毒后成活率的影响（见表5）

表5 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑哈维氏弧菌攻毒后成活率的影响（%）

由表5可知，哈维氏弧菌攻毒之后，与对照组相比，乳化鱼油组、四个益生菌添加组的免疫保护率都有一定的提升。Diet 2组获得最大的免疫保护率，为75%；Diet 1、Diet 3和Diet 4次之，为50%；乳化鱼油组最小，为25%。

3 讨论

3.1 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑生长性能的影响

芽孢杆菌被鱼吃进肠道后，可以在肠道中定植和增殖，产生多种氨基酸和维生素类营养物质；还可以产生多种肠道消化酶，提高饵料利用率，从而促进动物生长。刘波等[11]在异育银鲫饲料中添加地衣芽孢杆菌提高了机体酶活性和生长性能，宋奔奔等[12]研究指出，短小芽孢杆菌能提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体长、存活率，且显著提高质量增加率。光合细菌是一类不放氧而进行光合作用的细菌总称，具有丰富的营养物质，还有多种生理活性物质，如B族维生素、叶酸、辅酶Q、类胡萝卜素等。研究表明，将光合细菌按1%比例拌料投喂草鱼能促进其生长[9]，沈锦玉等[13]按1%或5%比例将光合细菌添加到饲料可以提高鲫鱼（Carassius auratus）、罗非鱼（Oreochromis spp）的生长。与上述研究结果一致，在本研究中以地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌按1∶1比例混合制成的芽孢杆菌或光合细菌分别拌料投喂虎龙斑60 d，各益生菌添加组相对于对照组和乳化鱼油组的生长性能和饲料利用率有显著增加，其中Diet 2组和Diet 3组极显著增加，这说明饲料中添加芽孢杆菌或光合细菌促进了虎龙斑的生长性能。

3.2 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑血清免疫力的影响

血清中的相关免疫酶活性在预防鱼类病害感染时，维持机体健康发挥着十分重要的作用。碱性磷酸酶是在所有生物体中参与许多重要功能的一种调控酶，其可以破坏有害物质的表面分子组成，加快有害物质的降解，防止病菌的繁殖等[14]，血清中的超氧化物歧化酶是机体内重要一种抗氧化酶，反映机体抑制氧自由基的能力。沈文英等[15]在草鱼饲料中添加芽孢杆菌显著提高了草鱼血清碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性，在饲料中添加1%的光合细菌，尖吻鲈（Lates calcarifer）血清碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性均高于对照组，但无显著差异性[16]。在本试验中，各益生菌添加组碱性磷酸酶活性都显著提高，Diet 2组的碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性极显著提高，这说明饲料中添加芽孢杆菌或光合细菌能提高血清的碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性。另外，溶菌酶活性是鱼类先天性免疫的一个重要指标，广泛存在于生命有机体内，也可以分解细菌的多糖壁，从而防止病害感染和疾病[17]，蛋白是血液中的重要化合物，血清总蛋白浓度被用作能够指示鱼类是否健康的免疫参数，其含量越高，说明机体蛋白质代谢越强，免疫力提高[18]。本试验结果表明，益生菌可以提高血清溶菌酶活性，其中Diet 2组和Diet 3组达到了显著水平，所有益生菌添加组虎龙斑血清总蛋白浓度含量均显著提高，这与赵晶晶等[19]对点带石斑鱼的研究结果基本相一致。综合上述分析，说明饲料中添加芽孢杆菌或光合细菌能够提高虎龙斑血清的免疫酶活性。

3.3 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑肝脏抗氧化能力的影响

在鱼类中，非特异性免疫机制包含有嗜中性粒细胞活化、过氧化物酶的产生和其他炎症因子的抑制[20]，总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽、过氧化氢和丙二醛等抗氧化酶活性可能会受到这些应激反应的影响。总抗氧化能力是机体抗氧化酶系统的综合反映，还原型谷胱甘肽是重要的抗氧化剂之一；过氧化氢是一类能催化过氧化氢分解为水和分子氧的过氧化物酶；丙二醛是一个脂质过氧化的重要标志物，这说明若总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽和过氧化氢等抗氧化酶活性提升和丙二醛水平降低，鱼类的非特异性免疫力和抗病力就有可能提高。已有大量研究表明，饲料中添加芽孢杆菌对团头鲂（Megalobrama amblycephala）、草鱼肝脏总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽和过氧化氢酶活性显著提高，并降低丙二醛的活性[15，21]。刘振兴等[22]研究发现，复合益生菌能够显著提高日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏抗氧化水平。在本试验中，与对照组和乳化鱼油组相比，芽孢杆菌组和光合细菌组都增加了总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽和过氧化氢的活性，降低丙二醛水平，就菌种分析来看，芽孢杆菌组对抗氧化能力的影响要比光合细菌组强，其中Diet 2组效果最显著。综合分析说明芽孢杆菌或光合细菌能够提高虎龙斑肝脏抗氧化能力，抑制自由基的形成，降低脂质过氧化的伤害。

3.4 饲料中添加不同益生菌对虎龙斑攻毒后成活率的影响

细菌攻毒试验经常被用作经过营养研究之后鱼体健康状况的一个最终指标[23]。能够使鱼引发弧菌病的哈维氏弧菌是一种广泛应用在鱼类免疫试验中的噬盐性革兰氏阴性菌，该菌能够引起养殖系统或野生水生环境中的鱼、虾和贝致病，给养殖户带来了重大的经济损失[24]。研究表明，饲料中添加益生菌能够显著提高虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、虾的抗病力和成活率[25-27]。在本研究中，饲料中添加芽孢杆菌或光合细菌提高了哈维氏弧菌攻毒之后虎龙斑的成活率，延后了其死亡出现时间。说明拌料投喂芽孢杆菌或光合细菌具有预防虎龙斑感染哈维氏弧菌的积极作用。

4 结论

在本试验条件下，通过对虎龙斑幼鱼生长性能、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶、血清总蛋白浓度、肝脏抗氧化酶活性和抗哈维氏弧菌能力的提升等综合考虑，表明饲料中添加益生菌有利于虎龙斑的生长，降低虎龙斑的饲料系数，提升虎龙斑的免疫力。