中间球海胆消化酶和抗氧化酶活力的研究

■左然涛 侯受权 李 广 常亚青

（大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023）

中间球海胆（Strongylocentrotus intermedius）原产于日本北海道和俄罗斯远东沿海，由于其性腺色泽好、味甜，在国际市场广受欢迎。1989年，由本课题组负责人参与引种将其引入中国，现已成为我国北方重要的海水养殖品种[1]。

目前，海胆养殖过程中饵料的主要来源为海带、裙带菜、石莼等大型藻类。海带、裙带菜的鲜活利用期主要在1～7月和12月这8个月份，而8～11月海胆养殖过程中几乎没有可利用的鲜活海带和裙带菜。但是，8～11月份对海胆养殖非常重要，因为春季的苗种在该时期已达稚胆规格，而成年海胆也进入育肥关键时期，此时饵料供应不足或质量不好将直接影响稚胆培育和亲胆促熟，从而大大影响海胆的养殖效果。海带和裙带菜的干品在8～11月的高温期易腐烂变质，氧化变质的蛋白和脂肪会严重影响稚胆的成活率，同时也会影响海胆亲胆的促熟效果。总之，海带和裙带菜等生物饵料在8～11月间存在价格贵、供应不稳定和营养不均衡等缺点。配合饲料因其原料来源广泛、搭配均衡且较低的饵料系数成为海胆养殖获得突破性发展的关键。

有关海胆配合饲料的研究已有一些报道。用配合饲料饲喂北方球海胆（Evechinus chloroticus），结果发现配合饲料能够显著改变性腺中如蛋白质、脂肪酸、氨基酸、糖原[2-3]等营养成分含量。但是，摄食配合饲料的海胆其性腺的品质较野生海胆有所降低，其中野生海胆的性腺质地更硬且味道较甜，而摄食配合饲料和海带的海胆性腺质地偏软且味道偏苦。该研究同时发现，甘氨酸与甜味呈显著正相关关系，而缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸与性腺的苦味呈显著正相关关系[3]。

目前，有关中间球海胆配合饲料的研究仅有少量报道。苏延明等(2008)[4]研究发现，四种营养型饲料对中间球海胆稚胆的饲喂效果依次为鲍用配合饲料＞青绿饲料＞能量饲料＞蛋白饲料。但有关中间球海胆消化酶测定的研究至今未见报道，消化酶活力分析有助于了解海胆对不同类型饲料原料（蛋白型原料、能量型原料和青绿型原料）的消化利用潜力[5]。尤其是在开展配合饲料开发研究的过程中，通过测定消化酶活力可以判断配合饲料营养成分对正常生理指标的影响[6]。较高的苗种成活率也是海胆养殖产业成功的关键，每年7～8月份的高温季节，热应激导致海胆幼胆大规模死亡的事件时有发生[7]。抗氧化酶能够有效清除热应激所产生的氧自由基，从而提高动物的抗热应激能力，但有关中间球海胆消化酶和抗氧化酶的相关研究至今未见报道。本研究以中间球海胆幼胆为研究对象，分析其消化道主要消化酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶AMS）及抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和总抗氧化能力T-AOC），以期为海胆幼胆人工配合饲料中主要营养成分配比的确定提供理论依据。

1 材料方法

1.1 试验动物

试验海胆幼胆来自农业部北方海水增养殖重点实验室，为当年同一批孵化所得，在养殖过程中饵料主要为海带、裙带菜和石莼等大型藻类。随机选取5只饲喂条件、规格一致的海胆，进行编号1至5。试验开始前对海胆进行称重，并测量其壳高和壳径，具体数据见表1。

1.2 消化酶活力的测定

在解剖盘的冰浴中解剖海胆，取肠道，-20℃保存。测定时4 ℃解冻，按重量（g）∶体积（ml）=1∶9比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液，即为粗酶液。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力及总蛋白含量测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，利用Epoch酶标仪（美国Biotek公司生产）进行测定。其原理、测定方法及酶活力单位定义均参照试剂盒说明书。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力及总蛋白含量的定义和计算公式如下。

表1 海胆幼胆的规格

胃蛋白酶活力定义：每毫克组织蛋白在37℃条件下，每分钟分解蛋白生产1 μg氨基酸相当于1个酶活力单位（1个酶活力单位=1 μg酪氨酸/min/mg组织蛋白）。

淀粉酶（AMS）单位定义：组织中每毫克蛋白在37℃条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。

脂肪酶（LPS）单位定义：在37℃条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位。

式中：A1——反应开始前的OD值；

A2——反应10 min后的OD值；

As——标准管的OD值。

1.3 抗氧化酶活力的测定

采用一次性注射器1 ml从海胆围口膜吸取体腔液，体腔液置于2.0 ml无菌离心管中，以12 000 r/min离心15 min，取上清液，即为体腔液样品。样品均置于超低温冰箱（-80℃）中以备用。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力和总抗氧化能力（TAOC）测定均采用南京建成生物技术公司生产的试剂盒，利用Epoch酶标仪（美国Biotek公司生产）进行测定。测定方法及酶活力单位定义均参照试剂盒说明书进行。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、总抗氧化能力的定义和计算公式如下：

超氧化物歧化酶活力定义：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

过氧化氢酶活力定义：每毫升血清或血浆每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活力单位。

式中：271——斜率的倒数。

总抗氧化能力（T-AOC）单位定义：在37℃条件下，每分钟每毫升血清（浆）使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。

2 试验结果

2.1 中间球海胆幼胆消化酶活力

中间球幼胆胃蛋白酶活力值为(7.72±0.92)U/mg pro,淀粉酶活力值为(1.98±0.31)U/mg pro，脂肪酶活力值为(17.71±1.37)U/mg pro，具体数据见表2。

2.2 中间球海胆幼胆抗氧化酶活力

中间球海胆幼胆SOD活力值为(20.36±0.62)U/ml，AOC活力值为(2.29±0.44)U/ml，CAT活力值为(8.08±2.02)U/ml，具体数据见表3。

表2 海胆幼胆消化酶活力（U/mg pro）

表3 海胆体腔液抗氧化酶活力（U/ml）

3 讨论

3.1 消化酶活力测定的意义

随着水产养殖业的发展，特别是随着水产配合饲料工业的发展，水产动物消化酶的相关研究愈加重要。了解水产动物消化酶的种类、活力及调控策略可以有助于优化水产养殖业中的饲料配方[8]。消化酶活力测定往往可以有效分析动物的食性，饲料中蛋白质、脂肪和碳水化合物的大概配比，从而为饲料中三大营养物质的添加提供理论依据[9]。其次，对于分泌量不足的消化酶种类可以通过外源性添加的方式进行弥补，从而显著提高饲料的消化利用率[10]。此外，通过对水产动物消化酶种类和活力的测定可以准确把握健康生理状态下的理化指标，在后期饵料学试验过程中，通过测定各饲料组动物的消化酶活力来反映不同饲料的使用效果，以此作为评价饲料质量及配方合理与否的重要依据[5]。

3.2 中间球海胆主要消化酶种类及活力分析

动物的食性因种类不同而异，即使同一种类，在不同的环境条件下和不同的发育阶段也不尽相同，其自身的消化酶组成状况与动物的食性密切相关。动物的食性与消化器官组织结构和消化机能是相适应的，消化器官组织结构不同，所承担的消化机能也不同，因而消化酶的活力也呈明显的差异[11]。通过比较肉食性、杂食性、草食性鱼类的淀粉酶和脂肪酶的活力，结果发现肉食性鱼类含有较高的脂肪酶，而草食性鱼类则含有较高的淀粉酶[12-13]。

中间球海胆为杂食偏植食性动物，在自然环境中，食物组成主要以海带、裙带菜和石莼等大型藻类为主[14]。对石莼[15]、裙带菜[16]、海带[17]营养成分分析后发现，蛋白质、纤维素和碳水化合物相对含量高。大连海域裙带菜营养成分含量如下：粗蛋白含量15.84%、脂肪含量3.18%、多糖含量41.21%、粗纤维含量9.45%、灰分36.45%、水分30.85%[16]。消化酶活力测定结果表明，中间球海胆（壳径均值32.42 mm）胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分别为(7.72±0.92)、(1.98±0.31)U/mg pro和(17.71±1.37)U/mg pro。一方面，中间球海胆消化道较高的蛋白酶和淀粉酶活力与海带中蛋白质和淀粉比例高有关；另一方面，本研究发现中间球海胆具有较高的脂肪酶活力，这说明中间球海胆具有较强脂肪利用能力，在养殖实践中发现，促熟期间饵料中添加贻贝肉会显著提高其性腺发育速率，与海带相比，贻贝肉具有较高含量的脂肪，海胆对贻贝肉较高的利用能力可能与其相对较高的脂肪酶活力有关。

3.3 中间球海胆主要抗氧化酶种类及活力分析

本研究中中间球海胆幼胆体腔液中SOD活力为(20.36±0.62)U/ml，AOC活力为(2.29±0.44)U/ml，CAT活力为(8.08±2.02)U/ml。丁君等[18]研究不同种海胆体腔液中酶活力，结果显示中间球海胆（平均壳径37.19 mm）SOD平均活力值为113 U/mg pro，马粪海胆（平均壳径32.84 mm）SOD平均活力值为144 U/mg pro，紫海胆（平均壳径32.89 mm）SOD平均活力值为182 U/mg pro，光棘球海胆（平均壳径38.21 mm）SOD平均活力值为155.76 U/mg pro。上述结果的差异可能与所使用的酶活力单位有关，本研究中抗氧化酶活力表示为每毫升体腔液所具有的酶活力单位。此外，不同海胆规格也可能是引起二者差异的原因。

4 小结

中间球海胆幼胆消化道中胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力分别为(7.72±0.92)、(17.71±1.37)、(1.98±0.31)U/mg pro；体腔液中超氧化物歧化酶（SOD）、抗氧化力（AOC）和过氧化氢酶（CAT）的活力分别为(20.36±0.62)、(2.29±0.44)、(8.08±2.02)U/ml。