尿液HCMV DNA检测在儿童HCMV感染中的临床应用*

张 华，詹 颉，赵 海，苏宝凤，苍金荣，宫艳艳，刘培培，杨瑞雪

(陕西省人民医院检验科，西安 710068)

人巨细胞病毒(HCMV)属疱疹病毒科，其感染人体后使感染细胞肿大并产生巨大的核内嗜酸性包涵体故称为巨细胞病毒。人群对CMV普遍易感，但大多数免疫正常个体出现无症状感染，而新生儿和婴幼儿因抵抗力较弱，感染后可出现明显症状。现对我院2014年1月～2015年12月收集的1 492例尿液标本HCMV DNA结果进行回顾性分析研究，报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2014年1月～2015年12月本院儿科及新生儿科住院的疑似人巨细胞病毒感染的患儿尿液标本1 492例，年龄0～12岁，其中新生儿(0～3月)78例，婴幼儿(3月～3岁)981例，学龄前儿童(3～6岁)249例，学龄期儿童(6～12岁)184例；收集的标本保存于4℃冰箱，48h内完成检测。

1.2 仪器与试剂 PCR扩增仪采用美国通用公司ABI 7500全自动实时荧光定量PCR扩增仪，按要求对仪器定期校验和维护；HCMV DNA检测试剂盒由上海复星长征医学科学有限公司提供，有生产许可证及严格的防污染技术。实验全过程遵守临床基因扩增检验实验室工作规范，实验操作人员要求持证上岗，严格按照标准操作程序进行操作。

1.3 检测原理 本品选取人巨细胞病毒株高度保守的非编码区为扩增的靶区域，设计特异性引物及荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术，检测尿液样本中人巨细胞病毒DNA。

1.4 检测方法 尿液混合均匀取1 000 μl，13 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀中加入1 000μl生理盐水重新悬浮，13 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀中加入50 μl裂解液，混匀后100℃加热10 min，13 000 r/min离心2 min，取4 μl上清液作为模板加入PCR反应液上机扩增。循环参数：50℃ 2 min；94℃ 5 min；再按94℃ 10s～60℃ 45 s循环40次，60℃采集荧光。

1.5 结果判断 在阴阳性对照和室内质控合格的情况下，Ct值小于38为阳性，Ct值大于40为阴性，对Ct值介于38～40的灰区标本按要求复检，如检测结果仍介于38～40之间则判断为阳性，否则为阴性。

1.6 统计学方法 计数资料应用配对χ2检验，采用SPSS13.0统计软件处理，以a=0.05为水准，即P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见表1、表2。新生儿组、婴幼儿组、学龄前组和学龄期组各种疾病时HCMV DNA检测结果之间比较χ2=9.253～23.452，P均<0.01。其中学龄期组与新生儿组比较χ2=23.452，P<0.001，差异有显著或非常显著的统计学意义；而表2的患儿几种常见疾病组中，肝功能异常组、支气管肺炎组和发热组之间χ2=0.356～0.865，P均>0.05，差异无统计学意义，而这三组与早产儿组和高胆红素血症组比较χ2=13.231，P均<0.01，差异有统计学意义。

表1 各年龄段HCMV DNA阳性的分布

表2 患儿常见疾病HCMV DNA阳性分布(n=1 482)

3 讨论

人类巨细胞病毒(HCMV)为临床常见的病原体，是新生儿和婴幼儿最常见的感染性疾病之一，其感染情况的临床表现多样化，几乎覆盖所有的重要器官，包括肺、肝、肾脏、骨髓、唾液腺、心脏和大脑，免疫力低下的患儿甚至引起多脏器损害[2]。在美国HCMV的感染率约为50%～70%，但是在发展中国家其感染率超过90%。在我国CMV抗体阳性率90%以上，即90%以上人群感染过CMV，大多数为无症状潜伏感染[3]。尽管HCMV在健康人群中基本无致病性，但是先天感染HCMV可导致新生儿神经系统缺陷，特别是免疫系统尚未成熟的新生儿初始和反复感染HCMV可导致严重疾病如肺炎、肝炎以及胃肠道相关疾病。

本结果显示在HCMV DNA阳性的291例患儿中，新生儿的HCMV-DNA阳性率最高(38.5%)，其次为婴幼儿(22.0%)，即随着年龄的递增HCMV DNA阳性率呈下降趋势，到学龄期儿童的感染率最低(4.9%)，各组之间均有统计学差异(P<0.01或P<0.001)。说明HCMV感染与患儿的年龄和免疫状态密切相关，新生儿由于免疫系统尚未健全HCMV DNA阳性率较高，3岁以后逐渐下降，即随着年龄的增长自身免疫系统逐渐完善，其HCMV的感染率逐渐下降，在学龄期儿童的感染率降为最低。新生儿的高感染率说明CMV感染途径主要为宫内感染和围产期感染，出生后感染次之。然而在孕妇原发或继发感染后，病毒通过胎盘直接感染胎盘滋养细胞和结缔组织细胞，而后到胎儿体内引起宫内感染[4，6]是新生儿高感染率的主要因素；而围产期感染可能经产道和母乳等途径获得。

在不同疾病组中，早产儿和高胆红素血症患儿的HCMV DNA阳性率最高(分别为43.5%和38.2%)，与其他组比较均有统计学显著性差异(P<0.01)，其余各组(肝功能异常、支气管肺炎患儿和发热等)之间均差异无统计学意义(P>0.05)。早产儿和高胆红素血症的HCMV高感染率基本和患儿的年龄有关，因为高胆红素血症的患儿基本都是新生儿，但是高感染率的HCMV是否导致胎儿的早产还有待于进一步研究。肝功异常、支气管肺炎和发热均有一定的HCMV感染率，这可能与HCMV感染导致全身多器官多系统损害，特别是累及肝脏和肺脏，其特点与有关报道相符合[5]。不过由于HCMV宫内感染引起胎盘功能出现异常，患儿缺氧、缺乏营养物质导致一系列代偿反应而导致早产，HCMV容易侵犯管道上皮细胞故引起患儿高胆红素血症、支气管肺炎和肝功能损害，但HCMV感染是否可直接导致患儿高胆红素血症和肝功损害其机制仍处于推测阶段，尚需进一步研究。

本研究结果显示新生儿和婴幼儿是人巨细胞病毒感染的高发人群，其中的早产儿和高胆红素血症患儿的HCMV DNA检出率高应引起重视。目前HCMV感染的实验室诊断方法较多，而HCMV DNA阳性是HCMV感染最直接的证据。而该研究利用回顾性分析方法，采用FQ-PCR技术检测1 492例疑似人巨细胞病毒感染的患儿尿液样本中的HCMV DNA，总检出率为19.5%(291/1 492)，低于相关文献报道的30%～40%，原因可能是本研究中统计样本时去除了反复检测的患儿，而且尿液样本的留取和保存影响因素较多，也不能排除地域差异。研究显示不同的样本类型会对FQ-PCR检测结果有直接影响，但是由于尿液样本简单易得，FQ-PCR技术灵敏度高，特异性强，特别是对于新生儿婴幼儿采集尿液样本比采集血液等相关样本更为快捷和方便，而且患儿无创伤，因此尿液HCMV DNA检测对患儿HCMV感染及相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

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