sCD93在免疫性血小板减少症患者中表达升高及临床意义*

李腾达，刘 鹏，谷明莉，邓顺江，吴林洪，叶 辛，刘 云，张薇薇，钱 琤，邓安梅

(1.第二军医大学长海医院，上海 200433；2.解放军100医院，江苏苏州 215007)

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是一种自身免疫性疾病，其特点是针对自身抗体敏感的血小板清除加快，产生量相对不足，血小板总量减少[1]。在ITP中，激活的自身免疫性T细胞增多，IFN-γ，IL-2等Th1型细胞因子与IL-17等Th17型细胞因子增多，与疾病严重程度相关[2]。而在T细胞适应性免疫过程中上游固有免疫Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)扮演了重要角色，它能够在免疫系统受到病原体攻击时快速识别一系列病原体相关模式分子[1]。ITP病人中TLRs信号通路的激活能增强促炎因子如IL-6，TNF-α等表达，从而使机体更有利于调动适应性免疫过程[1]。

CD93(也叫C1qRp)，是一种跨膜糖蛋白，表达于单核细胞、表皮细胞等细胞表面，溶解形式为sCD93，与细胞黏附和吞噬作用密切相关[3]。有报道显示CD93能诱导单核细胞分化为巨噬细胞，扩大TLR通路反应和促炎因子如TNF-α的产生[4]。近来CD93在自身免疫疾病中的作用逐渐突显，在系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)中，血清中sCD93升高，与TLR配体、TNF-α表达相关[5]；在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)与骨关节炎的对照研究中，sCD93在RA中显著上升，与疾病形成相关[4]。然而，在ITP中CD93的作用机制尚未明确，本文通过分析sCD93在病人血浆中的表达水平及其与TNF-α等细胞因子的相关性，为进一步研究CD93在ITP疾病形成过程中的生物学作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 研究对象 实验组为34例2012年5月～2015年8月在上海长海医院血液科确诊ITP患者，其中新诊患者19例，慢性患者15例，男性14例，女性20例，平均年龄34.4±17.8岁。新诊断患者为新确诊ITP病人，且之前无可靠的临床或实验室确诊证据；慢性患者为已经确诊为ITP且持续12月以上的病人。对照组34例为同期体检的健康个体，男性16例，女性18例，平均年龄36.8±18.9岁，两组间性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经第二军医大学长海医院医学科研伦理委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 ELISA试剂盒(美国eBioscience公司)，酶标仪(Thermo Scientific公司)，生物分光光度计(德国Eppendorf公司)，离心机(上海戴宝)。

1.3 方法

1.3.1 血浆收集及PBMC的分离：抽取研究对象2 ml左右的EDTA-K2抗凝无菌外周血，3 000 r/min离心10 min后，将血浆转移至EP管中于-80℃冻存。

1.3.2 ELISA法检测血浆sCD93及细胞因子的蛋白水平：按照ELISA试剂盒操作说明进行sCD93及相关细胞因子的检测。如下：每个反应孔中加0.1 ml 1～10 μg/ml抗体稀释液，4℃过夜。次日，弃孔内液，洗涤，加0.1 ml适宜浓度的样本于反应孔中，37℃反应1 h后洗涤。加入0.1 ml酶标抗体，37℃，1 h后再洗涤。最后加TMB显色，25 min后加2 mol/L硫酸终止反应，于450 nm处检测。

1.4 统计学分析 两组间连续性计量资料的比较采用两独立样本的t检验，sCD93与细胞因子的相关性以Pearson系数表示，检验水准为0.05。统计软件为GraphPad Prism 6.0。

2 结果

2.1 实验组与对照组血浆中sCD93的表达水平 实验组血浆中sCD93蛋白水平为367.28±206.98 ng/ml，对照组为218.43±96.14 ng/ml，差异具有统计学意义(t=3.803，P=0.000 3)。

2.2 实验组与对照组细胞因子的表达水平 见表1。

表1 实验组与对照组细胞因子表达的比较

与对照组比较，实验组血浆中TNF-α，IL-4，IL-17和IFN-γ蛋白表达量增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中TNF-α的表达量约为对照组的5倍，IFN-γ约为对照组的4倍，IL-4约为对照组的2倍。

2.3 实验组sCD93与细胞因子的相关性分析 实验组ITP患者血浆中sCD93与TNF-α，IL-17表达水平呈正相关，差异具有统计学意义(r=0.448,0.473；均P<0.05)；与IL-4，IFN-γ不具有相关性(r=0.198,0.245，均P>0.05)。

3 讨论

ITP是一种基因异质性的血液疾病，不同群体有不同的致病原因、发病史和疗效[1，6]。儿童ITP患者常有近期感染史[7]，成人ITP则常伴有人类免疫缺陷病毒、幽门螺旋杆菌、丙肝病毒等慢性感染[1]。ITP疾病常常伴有Th1，Th2，Th17细胞亚群的失调和Tregs，Bregs细胞的免疫缺陷[1，2]。研究显示ITP病人中，针对血小板自身抗原的T细胞分泌IL-2，IFN-γ增加，这表明CD4+T细胞群的分化趋向于Th1细胞亚群。此外，Th17细胞与IL-17产量也增加，表明Th17可能参与了ITP的免疫病理过程[2，7]。固有免疫中单核细胞被认为是组织性巨噬细胞和树突状细胞的前身，在激活和极化自身免疫相关Th细胞方面有重要作用，实验表明去除CD16+单核细胞能升高Treg细胞和Th17细胞，抑制Th1细胞。在ITP中，CD16+单核细胞能促进Th1细胞因子分泌，同时抑制Treg和Th17细胞[2]。而TLRs作为固有免疫反应的哨兵，在连接固有免疫和适应性免疫反应中起到了重要作用。最近有研究表明，血小板的TLRs能促进树突状细胞抗原提成，在适应性免疫反应中起到了重要作用，这表明在ITP等血小板相关性疾病中TLRs信号通路亦扮演了重要角色[1]。

CD93是一种跨膜糖蛋白，其细胞外结构包括C-型外源凝集素样区域，系列EGF样重复序列，高度糖基化黏蛋白样区域，最近有研究表明CD93在调节凋亡细胞吞噬作用、维持组织稳态和损伤修复方面有重要作用[8]。研究表明CD93在上皮细胞的表达与血管重建相关，意味着其参与了血管重建过程，与急性炎症、慢性炎症反应相关[9，10]。在以THP-1为模型的细胞试验中发现，CD93在单核细胞分化为巨噬细胞之前能促进LPS诱导的TNF-α的产生[4]。在试管试验中发现，TNF-α或LPS的刺激能导致CD93从单核细胞释放成为sCD93，而sCD93能扩大TLR介导的单核细胞产生细胞因子，从而提高单核细胞TLR通路的敏感度[5]，更有利于机体调动适应性免疫过程[1]。基于CD93在免疫调节方面的作用，其在自身免疫如SSc，RA中亦备受关注，然而其在ITP中的作用机制尚不明确，本研究发现sCD93在ITP中上升，且与IL-17，TNF-α呈正相关，证明其可能参与了ITP的免疫性致病过程，但本实验样本均来自同一地区，且样本例数较少，有待扩大样本进一步进行验证和深入研究。

[1] Lazarus AH，Semple JW，Cines DB．Innate and adaptive immunity in immune thrombocytopenia[J]．Seminars in Hematology，2013，50(Suppl 1)：S68-S70．

[2] Yazdanbakhsh K，Zhong H，Bao W．Immune dysregulation in immune thrombocytopenia[J]．Seminars in Hematology，2013，50(Suppl 1)：S63-S67．

[3] Sigari N，Jalili A，Mahdawi L，et al．Soluble CD93 as a novel biomarker in asthma exacerbation[J]．Allergy Asthma & Immunology Research，2016，8(5)：461-465．

[4] Jeon JW，Jung JG，Shin EC，et al．Soluble CD93 induces differentiation of monocytes and enhances TLR responses[J]．Journal of Immunology，2010，185(8)：4921-4927．

[5] Yanaba K，Asano Y，Noda S，et al．Augmented production of soluble CD93 in patients with systemic sclerosis and clinical association with severity of skin sclerosis[J]．The British Journal of Dermatology，2012，167(3)：542-547．

[6] 叶 辛，石 磊，谷明莉，等．原发性免疫性血小板减少症患者颗粒溶素、颗粒酶B、穿孔素的表达及临床意义[J]．现代检验医学杂志，2014，29(1)：20-23．

Ye X，Shi L，Gu ML，et al．Expression of granzyme B，granulysin and perforin from patients with primary immune thrombocytopenia[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2014，29(1)：20-23．

[7] Price V．Auto-immune lymphoproliferative disorder a-nd other secondary immune thrombocytopenias in childhood[J]．Pediatric Blood & Cancer，2013，60(Suppl 1)：S12-S14．

[8] Greenlee-Wacker MC，Galvan MD，Bohlson SS．CD9 3：recent advances and implications in disease[J]．Current Drug Targets，2012，13(3)：411-420．

[9] Liu C，Cui Z，Wang S，et al．CD93 and GIPC expression and localization during central nervous system inflammation[J]．Neural Regeneration Research，2014，9(22)：1995-2001．

[10] Galvagni F，Nardi F，Maida M，et al．CD93 and dystroglycan cooperation in human endothelial cell adhesion and migration adhesion and migration[J]．Oncotarget，2016，7(9)：10090-10103．