液相色谱-串联质谱法检测血清25-羟基维生素D的方法建立和性能评价

宋斌斌，　秦嘉倩，　彭颖斐，　张春燕，　吴　炯，　王蓓丽，　郭　玮，　潘柏申

液相色谱-串联质谱法检测血清25-羟基维生素D的方法建立和性能评价

宋斌斌，秦嘉倩，彭颖斐，张春燕，吴炯，王蓓丽，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

摘要：目的建立定量检测血清25-羟基维生素D[25(OH)D]的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法，并对此方法进行基本分析性能验证。方法使用Waters®XevoTMTQ MS ACQUITY UPLC®液质联用仪(LC-MS/MS)同时定量检测血清中的25(OH)D2和25(OH)D3含量。参照美国食品和药品管理局(FDA)的生物分析方法验证导则标准对所建方法进行线性、检出限、精密度和准确性等基本性能的验证。结果LC-MS/MS检测25(OH)D2和25(OH)D3的线性范围为6.25～500.00 nmol/L；25(OH)D2和25(OH)D3的定量检出限分别为2.50和1.25 nmol/L；批内、批间变异系数(CV)分别为<4%、<6%；回收率为93.26%～112.16%；维生素D国际室间质量评价计划(DEQAS)室间质评结果偏倚<10%。结论建立的LC-MS/MS基本性能符合评价标准，能够灵敏且准确的检测出血清中25(OH)D2和25(OH)D3 的浓度。

关键词：25羟基维生素D；液相串联质谱；性能验证

Establishment on a LC-MS/MS and its performance characteristic evaluation for the determination of serum 25-hydroxyvitamin DSONGBinbin,QINJiaqian,PENGYingfei,ZHANGChunyan,WUJiong,WANGBeili,GUOWei,PANBaishen

.(DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitation determination of serum 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] and perform the general method performance verification. MethodsThe LC-MS/MS was used for the quantitation determination of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 in serum by Waters®XevoTMTQ MS ACQUITY UPLC®mass spectrometry instrument. According to US Food and Drug Administration (FDA)′s guideline (Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation), the general method performance verification was performed for linearity, determination limit, precision and accuracy. ResultsThe linear ranges of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 were 6.25-500.00 nmol/L. The LC-MS/MS had quantitation determination limits of 2.50 nmol/L for 25(OH)D2 and 1.25 nmol/L for 25(OH)D3. The within-run and between-run coefficients of variation (CV) of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 were <4% and <6%, respectively. The recovery rates were 93.26%-112.16%. The result of the Vitamin D External Quality Assessment Scheme (DEQAS) interlaboratory quality assessment had a bias <10%. ConclusionsThe basic performance of LC-MS/MS meets the evaluation standards, and LC-MS/MS is sensitive and accurate for detecting the concentrations of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 in serum.

Key words:25-hydroxyvitamin D; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Performance verification

维生素D是一种对骨骼和非骨骼组织都有多效功能的类固醇激素。在循环血液中，维生素D以多种形式存在，其中25-羟基维生素D[25(OH)D]是其储存形式，含量最高，占维生素D总量的95%，而且半衰期最长，性质非常稳定。因此，25(OH)D是衡量体内可利用维生素D水平、客观评价维生素D营养状况的最佳指标[1-2]。近年来，许多研究都发现机体维生素D水平与肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、代谢综合征等存在相关的风险因素[3-7]。因此，维生素D的检测在临床上得到大量的应用，各种检测方法和商业化的试剂也应运而生。但是，各种免疫学方法由于受检测抗体的交叉反应、与维生素D2和维生素D3的识别结合率不一致的限制，其检测的准确性问题一直受到争议[8-12]，而使用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)能够有效的避免这些问题，被国际公认为检测的金标准[13-15]。我们建立了一种能快速定量检测血清25(OH)D2和25(OH)D3的LC-MS/MS方法，并对其进行性能评价。

材料和方法

一、仪器和试剂

Waters®XevoTMTQ MS ACQUITY UPLC®液质联用仪，色谱柱为BEH Phenyl(1.7 μm,2.1 mm×50 mm，美国Waters公司)，保持柱温35℃。标准品为纯25(OH)D2(412.65 g/mol)和25(OH)D3(400.64 g/mol)，购自美国Toronto Research Chemicals公司；内标品为25(OH)D2-d3(415.64 g/mol，美国IsoSciences公司)和25(OH)D3-d6(406.67 g/mol，美国Toronto Research Chemicals公司)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；异丙醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Roe Scientific公司)；乙酸铵(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；硫酸锌(色谱纯，沃凯公司)；Oasis HLB固相萃取(solid phase extraction，SPE)柱(美国Waters公司)。

二、方法

1．标准品制备分别将纯25(OH)D2和25(OH)D3标准品溶于1 mL甲醇溶液中，得到浓度分别为10和100 mg/L的母液。再将母液用甲醇稀释成2.00、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05和0.025 mg/L的一级标准品，每管50 μL分装后-80℃保存备用。每次实验将各浓度的一级标准品室温复溶后取15 μL，加入135 μL含4%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，充分混匀，配制成二级标准品(浓度分别为200.0、100.0、50.0、25.0、10.0、5.0和2.5 μg/L)，4℃保存，不能反复使用。

2．内标品制备分别将纯25(OH)D2-d3和25(OH)D3-d6溶于1 mL甲醇溶液中，得到浓度为20和10 mg/L的母液。再将母液用甲醇稀释成浓度均为2 mg/L的一级内标品，每管50 μL分装后-80℃保存备用。每次实验时将一级内标品室温复溶后取15 μL，加入135 μL含4%胎牛血清的PBS，充分混匀，配制成二级内标品(浓度为200 μg/L)，4℃保存，不能反复使用。

3．流动相工作液制备流动相A1为 0.077 g 乙酸铵、500 μL甲酸和500 mL去离子水的混合溶液；流动相A2为纯去离子水；流动相B1为0.077 g乙酸铵、500 μL甲酸和500 mL纯甲醇的混合溶液；流动相B2为纯甲醇。

4．样本抽提和萃取取血清样本150 μL、0.2 mol/L硫酸锌150 μL、内标品20 μL和纯甲醇溶液600 μL，震荡器充分混匀后3 000×g离心5 min，取600 μL上清液进行SPE(流速：1 mL/min)和洗脱(流速：3 mL/min)，收集洗脱液待测。标准品和内标品的处理方式与待测样本一致。

5．LC-MS/MS取20 μL样品洗脱液进行检测。质谱调谐参数设置：毛细管电压为3 kV、锥孔电压为30 V、脱溶剂气温度为350℃、脱溶剂气流量为650 L/h、反吹气流量为0 L/h。质谱测量参数设置详见表1。

表1　质谱测定参数设置

三、方法学评价

参照美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)的生物分析方法验证导则标准[16]对建立的LC-MS/MS进行基本分析性能验证。

1．线性评价将浓度为500 nmol/L的标准品稀释为7个浓度(250.00、125.00、62.50、25.00、12.50、6.25 nmol/L)，重复检测2次，取均值。各浓度的检测偏倚<15%，且曲线的回归系数(r2)>0.99可判断为呈线性。

2．定量检出限系列稀释标准品，每个浓度重复检测5次，将同时满足变异系数(CV)≤20%、偏倚<20%、信噪比(signal-noise ratio, S/N)>10∶1 的最低浓度值定为定量检出限。

3．精密度评价使用高、中、低3个浓度的混合血清作为待测样本，分别同时检测15次，评价批内精密度；将混合血清分装-20℃保存，连续检测5 d，每天重复3次，评价批间精密度。

4．回收实验在2份已知浓度的混合血清中同时加入不同浓度的25(OH)D2和25(OH)D3标准品作为待测样本，每份样本重复检测3次，取均值，并与理论值进行比较，计算回收率。回收率在80%～120%之间判断为可接受。

5．准确度评价检测维生素D国际室间质量评价计划(Vitamin D External Quality Assessment, DEQAS)5份样本的总25(OH)D，重复2次取均值，与回报结果的组均值做偏倚比较，偏倚在±10%之间判断为可接收。

四、统计学分析

结果

一、标准曲线和线性评价

LC-MS/MS检测血清25(OH)D2和25(OH)D3的色谱图和定标曲线见图1，检测线性范围为6.25～500.00 nmol/L，见表2。

注：(a)～(d)分别为25(OH)D3、内标25(OH)D3-d6、25(OH)D2和内标25(OH)D2-d3的色谱图；(e)、(f)分别为25(OH)D2和25(OH)D3 的标准曲线

图1LC-MS/MS检测血清25(OH)D2和25(OH)D3的色谱图和标准曲线

二、定量检出限

LC-MS/MS定量检测血清25(OH)D2和25(OH)D3的检出限分别为2.50和1.25 nmol/L。见表3。

三、精密度评价

采用LC-MS/MS分别检测25(OH)D2和25(OH)D3，并将两者结果相加得总25(OH)D结果。总25(OH)D的批内、批间CV分别<4%和<6%，见表4。

四、准确度评价

回收实验的回收率结果最低为93.26%，最高为112.16%，准确度符合要求，见表5。DEQAS检测结果的偏倚为-11.2%～5.3%，符合准确度评价标准，见表6。

表2　LC-MS/MS检测血清25(OH)D2、25(OH)D3的线性评价　(nmol/L)

表3　LC-MS/MS的定量检出限评估结果　(nmol/L)

表4　LC-MS/MS的精密度评估结果 [总25(OH)D]

表5　回收实验[25(OH)D2+25(OH)D3]　(nmol/L)

表6　LC-MS/MS检测DEQAS样本总25(OH)D的结果

讨论

准确检测25(OH)D一直是临床实验室面临的挑战[17]。学者们均希望能够找到一种快速、灵敏、特异且重复性好的高通量方法。自2004年第1次报道使用LC-MS/MS检测25(OH)D以来，质谱技术有了飞速的发展，并且使用这种方法建立了25(OH)D检测的参考测量程序[14，18]。质谱法有许多优点，如灵敏度高、准确性好，可以通过变换不同的流动相和内标物质同时检测多种维生素D代谢物质[19]。本研究建立的LC-MS/MS方法能够独立的同时检测出血清25(OH)D2 和25(OH)D3 浓度。

LC-MS/MS检测25(OH)D的过程中涉及两个关键的步骤：样本前处理和质谱分析。本研究使用Waters Oasis HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) SPE小柱对血清样本中的25(OH)D进行SPE。这种小柱具有亲水亲脂的特性，pH值适用范围广(pH值1～14)，使用非常方便，且使用96孔微孔板可以批量处理，每批次可以同时处理96个标本，总共耗时3 h(其中试剂平衡1 h)，平均每个样本的检测时间是4.6 min，可以满足高通量的检测要求。在质谱分析方面，本研究使用的是MS检测器[多反应监测法(multi-reaction monitoring，MRM)]，将待测物质先离子化[电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)]，之后进入三重四级杆。离子进入第一道四级杆时，检测到母离子的质荷比，接着母离子进入第二道四级杆，即碰撞池，可以施加电压将母离子撞碎，形成许多具有不同质荷比的子离子(母离子碎片)。子离子进入第三道四级杆，选择性地检测所需要的子离子，一般选用和待测物质的内标物质质荷比相近的子离子作为待测物。此方法通过同时检测母离子和子离子，保证了25(OH)D及内标物质检测的特异性。

参照美国FDA的生物分析方法验证导则标准对建立的LC-MS/MS进行基本性能验证。结果表明本方法的线性范围为6.25～500.00 nmol/L，25(OH)D2和25(OH)D3的定量检出限分别为2.50和1.25 nmol/L。此灵敏度和线性检测范围足够满足日常临床评估个体维生素D状态的需要，与其它文献报道[20-21]的线性性能类似。精密度评价结果显示本方法的批间精密度为<6%、批内精密度<4%，优于一些免疫学检测方法[22]，与HERRMANN等[22]的研究结果基本一致。回收率为93.26%～112.16%，符合准确度的性能验证要求。SHAH等[20]报道C3-epimer-25(OH)D2 会影响质谱法的检测结果。但此类维生素D的代谢产物只存在于儿童体内，不会对成人样本造成影响，因此本研究未对其进行验证。DEQAS是目前全球最具影响力的维生素D检测的实验室室间质量评价计划，参加的实验室数已经超过1 000家，通过检测该组织发放的血清样本并与同方法组结果进行比较能够很好的反映检测方法的准确性。本研究结果也证实了所建方法的准确性。

总之，本研究建立的LC-MS/MS可以准确、精密地检测25(OH)D，实现实验室大通量样本检测，并且能同时检测25(OH)D2和25(OH)D3。通过性能验证表明所建方法性能优异，适合临床应用。

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(本文编辑：龚晓霖)

收稿日期：(2014-04-03)

作者简介：宋斌斌，男，1975年生，硕士，主管技师，主要从事临床免疫检验工作。 潘柏申，联系电话：021-64041990-2376。

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划课题资助项目(2012BAI37B01)；国家临床重点检验专科建设项目资助项目

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0416-05Q565

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.003