HPLC-MS/MS同位素稀释法测定人体血清中类固醇激素的研究

周亚飞，　王月婷，　于嘉屏

HPLC-MS/MS同位素稀释法测定人体血清中类固醇激素的研究

周亚飞，王月婷，于嘉屏

(上海迪安医学检验所研发实验室，上海 200433)

摘要：目的建立一种能同时测定血清中多种类固醇激素[包括脱氢表雄酮(DHEA)、17α-羟孕酮(17α-OHP4)、雄烯二酮(AD)、雌酮(E1)、皮质酮(CORT)、双氢睾酮(DHT)、孕烯醇酮(P5)和17-羟孕烯醇酮(17-OHP5)]的快速、灵敏的稳定同位素稀释高效液相色谱串联质谱(ID-HPLC-MS/MS)方法。方法血清样品经甲基叔丁基醚(MTBE)提取，上清液吹干后加入羟胺进行柱前衍生化反应后检测。采用Phenomenex C18反相色谱柱和Phenomenex C18预保护柱。流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的甲醇。质谱采用电喷雾电离(ESI)模式进行离子化，正离子多反应监测模式(MRM)扫描，内标法定量分析。结果血清中8种类固醇激素最低定量限[LLOQ，以信噪比(S/N)≥10为标准]为0.03～0.625 ng/mL；在0.05～50.00 ng/mL范围内线性良好，相关系数(r)均≥0.998 0；批内精密度为1.93%～13.81%，批间精密度为4.90%～16.18%，加标回收率为80.0%～130.6%。结论建立了同时测定8种类固醇激素的ID-HPLC-MS/MS。该法灵敏度高、特异性强、准确且高效，可在10 min内完成分离和检测，适用于人体血清中类固醇激素的定量分析。

关键词：类固醇激素；血清；稳定同位素稀释；液相色谱；串联质谱

Research on the determination of serum steroid hormones by isotope dilution HPLC-MS/MSZHOUYafei，WANGYueting，YUJiaping

.(ResearchandDevelopmentLaboratory，ShanghaiDianMedicalTestingInstitute，Shanghai200433，China)

Abstract：ObjectiveTo establish a rapid, sensitive and stable isotope dilution high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(ID-HPLC-MS/MS) for simultaneous quantitative determination of dehydroepiandrosterone(DHEA)， 17 alpha-hydroxyprogesterone(17α-OHP4)， androstenedione(AD)， estrone(E1)， corticosterone(CORT)， dihydrotestosterone(DHT)， pregnenolone(P5)and 17-hydroxylpregnenolone(17-OHP5). MethodsThe steroid hormones were extracted from human serum by methyl tert-butyl ether(MTBE)， and the supernatant was treated with hydroxylamine to produce post-column derivatives before detection. Steroid hormones were separated by Phenomenex reversed-phase C18 with precolumn. Water containing 0.1% formic acid and methanol containing 0.1% formic acid were used as mobile phase A and B，respectively. Multiple reaction monitoring(MRM)with the positive ion detection mode was applied to selectively detect these 8 steroid hormones ionized by electrospray ionization (ESI) interface， and the quantitative analysis for them was carried out by using deuterium isotope as internal standard. ResultsThe lower limits of quantitation(LLOQ)of these 8 hormones can reach 0.03-0.625 ng/mL on the basis of signal-noise ratio (S/N) ≥10. The correlation coefficients(r)were ≥0.998 0 with a good linear at the concentration of 0.05-50.00 ng/mL. The within-run precision was 1.93%-13.81%, and the between-run precision was 4.90%-16.18%. The recoveries were 80.0%-130.6%. ConclusionsThe ID-HPLC-MS/MS is established for simultaneous quantitative determination of 8 kinds of steroid hormones. It has the advantages of sensitivity, specificity and accuracy， which is suitable for the separation and determination of steroid hormones for human serum samples within 10 min.

Key words：Steroid hormone； Serum； Stable isotope dilution； Liquid Chromatography； Tandem mass spectrometry

类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来，其包括雄激素、雌激素和肾上腺皮质素，是身体发育、性成熟及新陈代谢所必须的。人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺增生、多囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等相关[1-2]。因此，建立一种可以同时准确测定多种类固醇激素的分析方法对于临床疾病的诊断具有非常重要的指导意义。

目前，测定类固醇激素常用的方法有放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)[3-4]、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[5]和高效液相色谱串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)[6-7]。常规的免疫法操作简单，但因存在交叉反应和基质干扰而导致其缺乏特异性，且灵敏度较低[8]。质谱法则因灵敏度高和特异性强已成为复杂基体样本(如生物样本)检测的强有力的工具[9-10]，尤其是LC-MS/MS，已有效地排除了假阳性信号的干扰，检测结果更加准确可靠，目前已广泛应用于药物监测[11-12]、新生儿筛查[13-15]、毒理学诊断[16-17]等多种临床应用领域。我们旨在建立一种能同时测定血清中8种类固醇激素，且前处理相对较简单、分析时间短、灵敏的同位素稀释高效液相色谱串联质谱(isotope dilution high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ID-HPLC-MS/MS)方法。同位素的加入避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困难，能够对待测物含量进行准确定量，以便为临床上男女激素水平的健康评估提供一种可靠的检测方法，让医师更精确的帮助面临健康挑战的人们恢复激素平衡、改善并预防慢性病及抗老化。

材料和方法

一、仪器及试剂

API 4000+三重四级杆质谱仪(Applied Biosystem公司)；kspert′ultra LC100液相色谱系统(配自动进样器)；医用高速冷冻离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；超纯水设备(成都优普超纯科技有限公司)；电热恒温干燥箱(上海森信实验有限公司)；氮吹仪(上海沪粤明科学仪器有限公司)等。标准品雌酮(estrone，E1)、孕烯醇酮(pregnenolone，P5)、皮质酮(corticosterone，CORT)、17α-羟孕酮(17alpha-hydroxyprogesterone， 17α-OHP4)、17-羟孕烯醇酮(17-hydroxylpregnenolone，17-OHP5)、雄烯二酮(androstenedione， AD)、脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone， DHEA)、双氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)购自于美国Sigma-Aldrich公司，稳定同位素内标氘代-雌酮(d2-E1)、d9-P4、d6-DHEA、d8-17OHP4和d3-T购自于加拿大Toronto Research Chemical公司，纯度均≥98%；甲醇(色谱纯)购自美国ACS公司；甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether， MTBE；纯度99.9%)、羟胺购自Sigma-Aldrich公司。配制乐氏生理盐水来替代空白血清基质。方法学研究实验的血清样本来自于上海迪安医学检验所2014年6月和7月份送检患者的血清样本。

二、ID-HPLC-MS/MS的建立

1. 标准溶液的配制分别称取适量标准品用甲基叔丁基醚准确定容，然后分装并放置-80℃保存备用。取其少量用甲醇准确定容稀释成浓度为100 ng/mL的标准溶液，置于-20℃保存。按照8种类固醇激素(E1、P5、CORT、17α-OHP4、17-OHP5、AD、DHEA、DHT)在人体血清中的大致含量将标准品按比例配制成混合标准品，再用乐氏生理盐水稀释到不同浓度。配制浓度为100 ng/mL的d2-E1、d9-P4、d6-DHEA、d8-17OHP4和d3-T混合内标水溶液备用。

2. 样品制备取200 μL血清加入1.5 mL离心管中，加100 ng/mL混合内标溶液20 μL，再加入600 μL MTBE，涡旋振荡10 min，12 000×g离心5 min，4℃静置30 min后取上清液用氮吹仪吹干，加入1.5 mol/L羟胺100 μL，混匀振荡10 min，再放入恒温箱60℃衍生化反应1 h，然后进行HPLC-MS/MS分析。

3. 色谱条件采用Phenomenex C18反相色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)和Phenomenex C18预保护柱。流动相A为H2O含0.1%甲酸，流动相B为甲醇含0.1%甲酸。采用梯度洗脱：0～1.5 min 90%的流动相A，1.5～2.5 min 45%的流动相A，2.5～7.5 min 5%的流动相A，平衡1 min，8.5～10.0 min回到90%的流动相A，流速为0.5 mL/min。柱温为35℃，进样体积为20 μL。

4. 质谱条件在电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)正离子检测模式下，采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)的质谱扫描模式。喷雾电压(ion spray，IS)为5 500 V；碰撞气(collision gas，CAD)为Medium；气帘气(curtain gas，CUR)为40 kPa；离子源雾化气(ion source GS1，GS1)和加热辅助气(GS2)均为60 kPa；去溶剂温度为550℃。同时监测了目标物P5(m/z 332.0→86.2)、17α-OHP4(m/z 361.0→112.2)、17-OHP5(m/z 348.0→330.3)、AD(m/z 317.0→112.2)、DHEA(m/z 304.2→253.2)、DHT(m/z 306.2→81.1)、CORT(m/z 410.0→377.2)和E1(m/z 286.0→253.0)以及同位素内标d2-E1(m/z 288.0→255.1)、d6-DHEA(m/z 310.3→219.2)、d8-17OHP4(m/z 269.2→115.1)和d3-T(m/z 307.0→112.2)。再分别对各个目标物的去簇电压(declustering potential，DP)、碰撞电压(collision energy，CE)和碰撞池出口电压(collision cell exit potential，CXP)等条件进行了系统优化，以便达到更高的稳定性和灵敏度。

三、方法学评价

1. HPLC-MS/MS条件优化为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，使用羟胺将类固醇激素中的羰基经过肟化反应[18]，采用MRM模式监测其衍生化产物的离子对(Q1/Q3)。首先，是质谱方法的建立和条件优化，在仪器的质量数已校准的条件下，激活“Mass Only”，先建立质谱采样方法，需经过关键的3步：第1步，Q1 SCAN确定母离子的质荷比；第2步，Product Ion Scan确定子离子的质荷比；第3步，根据母、子离子组建MRM离子对Q1/Q3。然后，使用“Ramp”选择不同离子对的DP、CE和CXP进行优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果。此外，其它一些参数如IS、CAD、CUR、GS1和GS2等根据仪器提供的参考范围选择合适的数值，以保证较强的信号强度。其次，优化色谱条件，连接LC-MS并平衡色谱柱，根据色谱分离情况，设置并优化梯度洗脱方法，使得峰型对称，不要求所有峰都基线分离，但要尽量避免基质干扰，优化后的梯度洗脱方式详见上述色谱条件。

2. 内标定量分析采用同位素内标定量法进行定量分析。利用Analyst软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。同时观察8种类固醇激素LLOQ的精密度和准确度，以信噪比(signal-noise ratio, S/N)≥10为标准，获得每种激素的LLOQ浓度。

3. 方法精密度取送检的男性混合血清做精密度实验，严格按照与之前相同的样品预处理方法重复处理10次，计算批内精密度。随后，相同的样品连续处理3 d，每天处理3或4个样品，计算批间精密度。精密度用变异系数(CV)表示。

4. 回收率实验随机选取一例患者的血清样品，其中1份不加标准品，其它3份分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定3次，计算回收率[回收率(%)=(添加标准品的血清激素浓度-未添加标准品的血清激素浓度)/添加的标准品浓度×100]。

四、统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。分别观察方法的批内、批间精密度和回收率。

结果

一、HPLC-MS/MS条件优化

从优化色谱图中看到的离子最高信号强度所对应的最佳结果见表1。以DHEA和17α-OHP4为例，在优化的条件下，获得的DHEA及其内标d6-DHEA、17α-OHP4及其内标d8-17OHP4的提取离子流图(extracted ion chromatogram，XIC)见图1。DHEA和17α-OHP4的检测浓度分别为5 ng/mL和1 ng/mL。从图1中可以看出虽然检测浓度很低，但XIC的峰型依然很对称，杂质干扰极小。

表1　类固醇激素的条件优化结果

注：(a)DHEA；(b)内标d6-DHEA；(c)17α-OHP4；(d)内标d8-17OHP4

图1DHEA及其内标d6-DHEA、17α-OHP4及其内标d8-17OHP4的XIC图

二、 内标定量分析

8种类固醇激素在0.05～50.00 ng/mL范围内的线性拟合方程显示线性良好，相关系数(r)均≥0.998 0，满足定量检测要求，见表2。8种类固醇激素的LLOQ见表2。

三、 精密度

批内精密度为1.93%～13.81%，批间精密度为4.9%～16.18%，见表3。

表2　类固醇激素的线性拟合、最低定量限和检出限结果

表3　8种类固醇激素的精密度结果

四、 回收率实验

8种激素的加标回收率为80.0%～130.6%，3次重复试验的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.6%～12.7%。见表4。

表4　8种类固醇激素的加标回收率结果

讨论

本研究采用ID-HPLC-MS/MS同时测定了血清中8种类固醇激素。目前，操作简单和成本低是免疫法的优势，但因其存在交叉反应和基质干扰而导致缺乏特异性，而且灵敏度较低。LC-MS/MS是同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，可极大的避免交叉反应的干扰。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基体的干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。

为了提高分析物的离子化效率，利用柱前衍生化法，采用羟胺与类固醇激素中的羰基发生衍生化反应，极大地提高了分析的灵敏度和稳定性，LLOQ(以S/N≥10为标准)可低至每毫升几十皮克，基本满足血清中一些痕量激素的检测要求。

本研究还观察了ID-HPLC-MS/MS检测8种激素的重现性和回收率。结果显示批内精密度为1.93%～13.81%，批间精密度为4.90%～16.18%，除E1的批间精密度相对略差外，其它7种类固醇激素的精密度均<15%[可接受标准为CV≤15%，但此标准也与待测物的浓度有关，若浓度过低(ng/mL级以下)可放宽至CV≤20%]。因此，该方法稳定性良好。此外，加标回收率为80.0%～130.6%，可接受标准为80%～120%，若浓度较低，可接受范围可放宽至70%～130%，而E1的回收率为130.6%。因此，除E1回收率相对略差外，其它7种激素基本可满足临床定量检测要求。与其它几种激素相比，E1的精密度和回收率较差，可能是由于其在人血清内的含量较低，相对而言仪器对它的S/N较大，从而导致检测结果的误差变大；精密度较差也可能与样品的保存、预处理过程和基体中其它物质对其的干扰有关。因此，可以通过定期清洗仪器或ESI喷雾针等方式尽量降低背景干扰，还可以选择更高性能的质谱仪器来检测含量过低的物质，如E1等。

综上所述，本研究建立的ID-HPLC-MS/MS灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10 min内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率能基本满足临床定量检测要求，可用于临床上血清类固醇激素的定量分析，为临床上男、女性激素水平的评估提供一种可靠的检测方法。

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(本文编辑：龚晓霖)

收稿日期：(2014-12-12)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0427-06R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.005

通讯作者：于嘉屏，联系电话：021-51816497。

作者简介：周亚飞，女，1987年生，硕士，主要从事生物有机质谱分析。