RNA干扰技术的研究进展

张　鑫　郝玉琴



·综述·

RNA干扰技术的研究进展

张鑫1，2郝玉琴1

RNA干扰技术具有高特异性、高效性等显著优势，近年在医学领域广泛应用，包括基因组研究、病毒性疾病治疗、肿瘤治疗、自身免疫性疾病治疗及新药开发等。本文就RNAi技术的研究现状作一综述。

RNA干扰技术；医学应用前景

2002年12月20日，RNA干扰(RNA interference，RNAi)被science杂志评为年度十大科技成就之首，Nature杂志亦将siRNA评为年度重大科技成果之一。RNAi 作为一门新兴技术以其高特异性、高效性等显著优势成为研究基因功能的全新手段，其在生物医学领域有着广阔的应用前景。

1　RNAi发展背景

1990年，Jorgensen试图在矮牵牛花中插入一种色素基因，希望能使花朵的颜色变得更深，结果却得到了白色花朵的矮牵牛花，当时他把这一现象称为共抑制[1]。1994年Cogoni 在真菌中发现同种现象,被其称为基因压制[2]。1995年，Guo等[3]用反义RNA技术阻断线虫par-1基因的表达时，发现正义RNA具有与反义RNA同样可以抑制该基因表达的作用。1998年Fire等[4]发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，遂将这种现象命名为RNA干扰(RNA interference)，简称RNAi。2001年Elbashir等[5]用siRNA率先在哺乳动物培养的细胞中诱导特异性基因沉默，从而开始了RNAi 技术在哺乳动物细胞中的研究应用。2002年，Brummelkamp等首次成功构建了小发夹RNA( small hairpin RNA，shRNA)表达载体，并发现转染该载体可特异性、有效地降低目的基因表达，为RNAi 技术在基因治疗中的应用研究奠定了基础[6]。

2　RNA干扰技术原理及特点

2.1RNAi包括两个阶段分别为起始阶段和效应阶段。在RNAi起始阶段中，加入的小分子RNA被切割成21-23 bp长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNA，siRNA)。Dicer酶是RNAseIII家族中特异性识别双链RNA的成员之一，它可以以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入的或是由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA(dsRNA)，将RNA降解为21-23bp的siRNA双链，并且每个片段的3'端都有2个突出的碱基。在效应阶段，siRNA双链结构结合一个核酶复合物，形成了RNA诱导的沉默复合物(RNAinduced silencing complex，RISC)。其正义链被释放出来后，反义链将作为引导链与靶mRNA作用。激活RISC需要一个ATP，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并且在距离siRNA 3'端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但是每个RISC都含有一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶[7]。

2.2RNAi的特点RNAi较反义寡核苷酸核酶、基因敲除等技术有着无可比拟的特点和优势：(1)高效性:少量的siRNA可以显著抑制目的基因的表达,具有催化放大效应；(2)高特异性:RNAi只降解同源mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响；(3)传播性:RNAi具有强大的细胞穿透力，抑制效应可以穿过细胞界限，干扰效应可遗传给后代；(4)ATP依赖性:RNAi的发生依赖于ATP的参与，因为在Dicer酶将dsRNA切割成siRNA过程及RISC过程均需要ATP的参与。

3　RNA干扰的方法及载体

3.1RNA干扰的方法目前RNA干扰的方法最常用的是直接转染siRNA和构建shRNA载体。目前获得siRNA主要有三种方法，化学合成、体外酶法合成和体内转录。因siRNA 相对分子量较小，在血浆中半衰期较短，极不稳定，siRNA在体内作用时间短，使其应用受到限制。shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，通过载体将克隆其编码的DNA导入细胞，在细胞中，shRNA被加工成siRNA，发挥抑制特异mRNA表达的作用,这种装载了shRNA的载体可以通过筛选稳定传递到子代细胞中去[8]。载体介导shRNA表达技术能长期和稳定地抑制靶基因的表达，这使不能持久抑制基因表达的问题迎刃而解，可用来构建理想的实验细胞模型，与化学合成siRNA法相比具有更大的应用潜力，因此shRNAs表达载体技术成为肿瘤基因治疗的强大工具。

3.2RNA干扰的载体载体是引入外源性基因不可或缺的重要工具，如何设计和构建能够跨细胞内外生理屏障，实现较高转染效率并具有低细胞毒性的基因载体系统一直是基因治疗领域的研究重点。目前基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。

3.2.1病毒载体病毒载体易于制备、纯化、浓缩，且具有宿主范围广、感染率高、理化性质稳定、不整合宿主基因组等优点，因此，使用频率较高。其中应用较多的为逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体。

逆转录病毒载体主要来源于莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，它能稳定的整合进宿主细胞中，但是只能感染增殖细胞中而不能有效地转导非增殖细胞。

腺病毒载体优点在于导入效率高，对增殖或非增殖细胞均可感染，载体包装能力强、细胞毒性反应低等优点。但还存在着外源基因表达的可控性差，无靶向性也可引起机体的免疫反应等。

慢病毒载体感染效率很高，且感染后整合稳定，慢病毒也可以感染分裂期和不分裂细胞[9]，如肌纤维细胞、神经细胞等。与逆转录病毒载体和腺病毒载体比较, 具有高效整合、高效转录、高效表达和宿主范围广的特点,因此成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。

3.2.2非病毒载体近年来，非病毒载体受到关注，其原因主要是非病毒载体系统安全性高、负载量大、生物相容性好、便于保存和检验等优势。目前在介导RNAi研究中较常用的非病毒载体主要有：阳离子脂质体转染效率相对较高，毒副作用较大；阳离子细胞穿膜肽生物降解性好，负载率尚有不足；树枝状大分子负载量大，转染效率不高；阳离子聚合物载体种类繁多，以聚乙烯亚胺为例，负载量大、转染效率较高、毒性大；纳米无机材料负载量大、毒性低、生物相容性好，但是转染效率有待提高[10]。纳米粒子作为非病毒载体，已被广泛用于RNAi技术的效应分子小分子干扰RNA的递送[11]。但纳米载体的设计仍然相当困难，DNA与纳米粒子的结合技术非常复杂，开发安全、高效、靶向的纳米基因转运载体任重而道远。

4　RNA干扰技术的应用

4.1基因功能研究的应用目前的研究是通过抑制某基因的表达来阐述该基因功能，通过RNAi特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能，较传统方法如基因敲除省时方便。随着人类基因组测序计划的完成，研究已经进入后基因组时代，基因组学的重心已由结构基因组学转向功能基因组学。RNAi技术以其高度特异性、高效性、操作简单等特点，成为研究基因功能的重要工具。许多研究工作者通过 RNAi 技术对人类基因组进行逐一“敲除”，并将细胞或者组织的表现记录下来，建立一个人类RNAi文库，为后续研究提供基础[12]。

4.2抗病毒治疗的应用RNAi是生物体内广泛存在的一种古老的基因水平的免疫监控机制，用以对抗病毒感染[13]。目前，借助RNAi技术治疗病毒感染性疾病仍然是其主要的应用研究领域。HIV感染目前还缺乏有效的疫苗和治疗方法，RNA干扰技术的问世，为HIV感染者带来新的希望。有学者[14]通过构建一株包含CCR5 shRNA、人类/猕猴TRIM 5α基因和核仁内反式激活反应元件类似物的慢病毒载体，感染了该重组慢病毒的CD34+造血干细胞在人源化免疫缺陷小鼠体内可以分化为HIV-1抗性的CD4+T细胞，这为HIV感染者的治疗提供了理论基础。此外RNAi 技术已经广泛应用于病毒基因的转录后调节，并且已经成功抑制了多种病毒的复制，如乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)[15]、丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)[16]、流感病毒(influenza virus A)[17]等。

4.3抗肿瘤治疗的应用肿瘤基因治疗的安全性、有效性及特异性的特点，使近年来受到越来越多的关注，并且取得了突出的研究成果。Zhen等[18]构建了靶向survivin的shRNA载体并转染神经胶质瘤U251细胞，体外实验流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)分析细胞显示：细胞有丝分裂发生障碍，凋亡明显增加。该作者通过建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA进行干预，定期观察并测量肿瘤大小，3周肿瘤体积和重量均明显低于对照组。实验还发现survivin-shRNA还可以抑制肿瘤血管的生成。Zhao等[19]用肺癌A549细胞作为研究对象，构建了livin和survivin的shRNA的真核表达载体，实验研究发现共转染组对肿瘤细胞的生长抑制和促凋亡作用明显高于对照组和单转染组。这些研究成果为RNAi技术在肿瘤治疗领域的应用奠定了理论基础。肿瘤是多个基因相互作用调控的结果，RNAi技术是一项高特异性和高效率的基因沉默技术，且RNAi可同时沉默多个肿瘤相关基因，因此RNAi技术成为目前肿瘤治疗方法的研究热点，其在肿瘤相关基因的功能研究和基因治疗方面具有广阔的应用前景。

4.4在自身免疫性疾病治疗中的应用RNAi技术近年来亦被用于自身免疫性疾病的研究,Crispin等[20]用siRNA技术处理系统性红斑狼疮(SLE)的T细胞，结果显示白细胞介素-2(IL-2)的分泌水平得以恢复。而IL-2的减少是SLE 最主要的免疫病理学表现。Wang等[21]通过RNA干扰人类枯草溶菌素转化酶6(PCSK6)，观察其对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)的影响，结果发现抑制RASF增殖、侵袭及转移，这表明抑制PCSK6可能在类风湿关节炎(RA)的发展起到一定的保护作用。这些研究成果表明，RNAi技术的出现无疑为自身免疫性疾病的治疗开辟了新的思路和途径。

4.5药物开发及应用利用 RNAi能够特异高效地抑制基因表达，获得去基因功能表型，能够在短时间内大规模筛选靶点，用RNAi技术筛选药靶和评定药靶大大缩短了药物研发时间。Duff等[22]通过RNAi技术减少蛋白转移酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK 9)的表达，发现能有效降低小鼠血清胆固醇水平，说明沉默PCSK 9可成为治疗高胆固醇的药物靶点。在筛选药物上，Liu-Sullivan等[23]通过pooled shRNA的方法发现维A酸类药物能增强PLK1激酶抑制剂药物GSK461364的抑制作用，进而阻止肺癌细胞有丝分裂，加速肺癌细胞凋亡的速度。癌症是多基因或多因素作用引起的疾病，靶向单个分子的RNAi药物通常不能满足治疗需要，因此有必要设计同时抑制疾病相关的多个关键基因的多靶siRNA来调控疾病的多个节点[24]。癌症的治疗几乎是多靶点药物组合疗法，它越来越多地用于艾滋病的预防和治疗、脑缺血、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病等[25]。

5　RNA干扰技术的展望

RNAi 沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这项技术成为生物医学领域一次划时代的革命。它的出现给基因功能研究、生物基因工程、医药研究提供了一种全新的方法。虽然RNAi技术在体内外实验研究中取得了一定的成果，并显示出良好的应用前景，但在该技术广泛用于临床前，仍存在一些问题亟待解决。如如何将siRNA安全有效的导入细胞，并使其在体内稳定表达。siRNA作为药物应用的主要障碍在于药物运送系统及给药方式，开发一个安全高效的运载系统仍是科研工作者和临床医师亟待解决的问题。随着研究的深入我们相信这些问题最终会被解决，RNAi作为一门新兴技术正显示着强大的生命力。该技术将更广泛地应用于生命科学研究和疾病的临床治疗中,这将是目前无法治疗的疾病在基因治疗方面的一场新革命。

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(收稿：2015-04-21修回：2015-08-26)

Update of RNA interference technology

ZHANGXin1，2,HAOYuqin1.

1.DepartmentofDermatology,ThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China; 2.InnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot010000,China

HAOYuqin，E-mail:haoyuqin0472@163.com

RNA interference (RNAi) technology is superiority of the high particularity and efficiency, which is wildly used in medical sciences including genomic research in medicine, viral therapy, the treatment of cancer and autoimmune diseases and new drug development. The update of RNA interference technology was reviewed.

RNA interference technology; medical application prospects

国家自然科学基金资助项目(编号：81260407 )

1内蒙古医科大学第三附属医院皮肤科，包头，014010

2内蒙古医科大学，呼和浩特，010000

郝玉琴，E-mail:haoyuqin0472@163.com