正交试验法优选真武汤的微波提取工艺

任　燕何兴会.成都中医药大学，四川　成都　60075; .贵州大学，贵州　贵阳　55005

正交试验法优选真武汤的微波提取工艺

任燕1何兴会2
1.成都中医药大学，四川成都610075; 2.贵州大学，贵州贵阳550025

【摘要】目的:优选出真武汤的微波提取最佳工艺.方法:采用微波提取方法，通过单因素实验和正交实验两者结合考察了乙醇提取浓度、提取时间、微波火力、料液比对真武汤中芍药苷得率的影响，从而优选出最优提取工艺.结果:真武汤提取工艺最佳条件为:乙醇浓度为60%，微波时间为3min，微波火力中高火，料液比为1∶10.结论:本研究将为真武汤的剂型开发等进一步研究奠定基础.

【关键词】真武汤;芍药苷;微波提取;正交实验

Optimization Microwave Extracting Process of Zhenwu decoction by Orthogonal Test

REN Yan1，HE Xing－hui2

1. Chengdu University of TCM，chengdu 610075，China; 2. Guizhou university，Guiyang 550025，China

Abstract:ObjectiveTo optimize the best microwave extraction process of Zhenwu decoction．MethodsUsing microwave extraction method and combining the single factor experiment with orthogonal experiment，explorating the effects of the ethanol concentration，extraction time，the extraction microwave power and material liquid ratio of Zhenwu decoction，through inspecting the quality of paeoniflorin in extracts of Zhenwu decoction，thus to select the optimum extraction method．ResultsZhenwu decoction extraction conditions were: ethanol concentration degree is 60%，the microwave time is 3 min，the high fire microwave firepower，the ratio of material to liquid is 1∶10．ConclusionThe experiment will lay the foundation for further study on dosage form development of Zhenwu decoction．

Key words:Zhenwu decoction; paeoniflorin; microwave extraction; orthogonal experiment

真武汤出自《伤寒论》，系张仲景针对少阴肾阳亏虚，气不化水，水气内停而设.全方由炮附子、白术、茯苓、生姜、芍药等五味药组成，具有扶阳抑阴、化气行水的效果，适用于脾肾阳虚、水气内停等证，为温阳利水之经典方.后世医家对本方进行了较为系统的研究，目前已突破了水病的范围，用本方治疗多个系统的疾病，如:慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、风心病、冠心病、充血性心力衰竭、慢性胃肠炎、肝硬化腹水、慢性肾炎、内耳性眩晕、血栓闭塞性脉管炎等疾病，疗效令人满意.该方虽应用很广，但对该方的提取工艺还未见有研究，从而也制约该方的制剂开发，故本文通过单因素及正交试验对真武汤的提取工艺作初步研究，以期能为开发该方新制剂奠定一定基础.

1　仪器和试剂

1. 1仪器WP700L17微波炉;电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂); UV －VIS分光光度计(UV－2450，日本岛津公司);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);数显恒温水浴锅(上海浦东光学仪器厂).

1. 2材料芍药苷标准品(中国药品生物制品鉴定所);所用试剂均为分析纯;中药材炮附子、白术、茯苓、芍药购于贵阳市药材公司，生姜购于菜市场;炮附子、白术、茯苓、芍药用粉碎机粉碎得药材粗颗粒;生姜切块，备用.

2　方法

2. 1芍药苷含量得率的测定方法

2. 1. 1标准品的制备精密称取100℃干燥恒重的芍药苷标准品4. 8mg于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0. 1920mg/ml标准储备液.精密量取0. 5、0. 7、0. 9、1. 1、1. 3、1. 5ml分别置于10ml容量瓶中，编号为1、2、3、4、5、6，加入甲醇定容至10ml，摇匀，甲醇做空白对照.

2. 1. 2芍药苷标准曲线的制作将配制好的对照品溶液进行波长确定，选出最大波长，最后确定最大波长为230nm.在230nm波长处测定吸光度，以浓度对吸收值做线性回归，得出回归方程: Y =30. 007X－0. 0273，R2=0. 9994，其中X是芍药苷标准品的浓度，Y是吸光度值.

2. 1. 3供试品的制备准确称取按真武汤复方处方准备好的药材量的1/3(既茯苓3. 00g，芍药3. 00g，生姜3. 00g，白术2. 00g，炮附子1. 40g)至250ml锥形瓶中，精密加入一定浓度的乙醇溶液后置微波炉中提取，冷却后补足失去的乙醇量，滤过，精确量取一定滤液(V)，蒸发至近干，加甲醇溶解，转入25ml容量瓶中，并定容至刻度，即得供试品溶液.

2. 1. 4芍药苷得率测定取供试品溶液于230nm波长处测定吸光度值，然后带入所得线性回归方程中计算，即可得样品中芍药苷的浓度，经进一步计算就得其得率.芍药苷得率的计算公式:得率= X×100×(25/V)×10－3/W*100%，式子中X为样品液中芍药苷的浓度(mg/ml)，V为精确量取蒸发的液体(ml)，W为真武汤药材总质量.

2. 2单因数实验

2. 2. 1提取时间的影响分别取按处方准备好的药材量的1/6(既茯苓1. 50g，芍药1. 50g，生姜1. 50g，白术1. 00g，炮附子0. 70g)，各六份，混匀.按料液比为1∶15加入70%的乙醇溶液，设定微波火力为中火(P = 50)，微波提取时间分别为1、2、3、4、5、6min，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度.

2. 2. 2微波火力的影响分别取按处方准备好的药材量的1/6(既茯苓1. 50g，芍药1. 50g，生姜1. 50g，白术1. 00g，炮附子0. 70g)，各五份，混匀.按料液比为1∶15加入70%的乙醇溶液，设定微波时间为3min，微波火力分别为微火(P =10)、中微火(P = 30)、中火(P = 50)、中高火(P =80)、最大火(P =100)，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度.

2.2.3料液比的影响分别取按处方准备好的药材量的1/6(既茯苓1.50g，芍药1.50g，生姜1.50g，白术1.00g，炮附子0.70g)，各五份，混匀.分别按料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1

∶20、1∶25加入70%的乙醇溶液，设定微波火力为中火(P = 50)，微波提取时间为3min，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度.

2. 2. 4乙醇浓度的影响分别取按处方准备好的药材量的1/6(既茯苓1. 50g，芍药1. 50g，生姜1. 50g，白术1. 00g，炮附子0. 70g)，各五份，混匀.按料液比为1∶15分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，设定微波火力为中火(P =50)，微波提取时间为3min，得提取液，最后测定芍药苷的吸光度.

2. 2. 5单因素实验结果随着提取时间的增加芍药苷的吸光度值先增大后减小，且在4min时有最大值;随着微波火力的增大，芍药苷的吸光度值先增大后减小，且在微波火力为中高火时有最大值;随着料液比的增大，芍药苷的吸光度值逐渐增大，后趋于平衡，其中在1∶20、1∶25时，趋于平衡;随着乙醇浓度的增大，芍药苷的吸光度值先增大后减小，且在浓度为70%时有最大值.

2. 3正交试验

2. 3. 1正交实验分别称取按处方准备好的药材量的1/3(既茯苓3. 00g，芍药3. 00g，生姜3. 00g，白术2. 00g，炮附子1. 40g)，各9份，混匀，根据单因素实验结果，进行L9(34)正交试验(见表1).

表1　因素水平表

2. 3. 2正交实验的结果由表2可知，根据K值各因素对实验指标的影响按大小次序排列为A＞D＞B＞C，即乙醇浓度＞料液比＞微波时间＞火力.由方差分析F值大小可得从真武汤中提取芍药苷的最佳条件为: A2B2C3D1，即乙醇浓度为60%，微波时间为3min，微波火力中高火，料液比为1∶10.

表2　正交实验的结果

2. 3. 3实验验证取上述处方药材三份，分别按上述最佳工艺条件A2B2C3D1，即乙醇浓度为60%，微波时间为3 min，微波火力中高火，料液比为1∶10，对实验结果进行验证，见表3.

表3　真武汤提取最佳工艺的验证结果表

由表3可知，按照正交试验所优选而得的最佳工艺进行提取试验，三次结果芍药苷含量均处于较高水平，这说明该最佳工艺是稳定可行的.

3　讨论

真武汤为经典方剂，临床用于心血管系统疾病、呼吸系统疾病、肾脏疾病、妇科疾病以及神经系统疾病等.现代研究证实，该方不但具有利尿、强心的作用，还有保护受损心肌、消除自由基、提高机体应激、促进新陈代谢抗衰老等作用[1].李景巍[2]、刘崇新[3]、荆世常[4]、何幼斌[5]等应用真武汤在临床上取得很好疗效.该方虽应用很广，但未见该方提取工艺的研究，从而也制约该方的制剂开发.另外，微波提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等许多优点，是天然产物提取中一种非常有发展潜力的新型技术[6－8].因此本文选择以乙醇浓度、微波时间、微波火力、料液比四个因素对真武汤中芍药苷的提取工艺进行考察，采用单因素以及正交实验两者相结合，以芍药苷为检测指标，考察真武汤中芍药的提取工艺.吴谦认为[9]:“真武汤尤妙在芍药之酸收，仲景之旨微矣.盖人之身阳根于阴，若徒以辛热补阳，不少佐以酸收之品，恐真阳飞越矣，用芍药者，是亟收阳气归根于阴也，于此推之，则可知误服青龙致发汗亡阳者，所以于补阳药中之必需芍药也.”所以检测芍药苷的含量具有代表性，芍药苷含量多少与该方的有效部位的溶出度有密切关系.故本实验用紫外分光光度法测定芍药苷得率，方法简单、易操作，且乙醇提取溶出的杂质少、溶剂可回收、比较经济.实验结果表明最佳的提取工艺为:乙醇浓度为60%，微波时间3 min，微波火力中高火，料液比1∶10;且验证实验结果表明该最佳工艺是稳定可行的.本文通过单因素及正交试验对真武汤的提取工艺作初步研究，以期能为开发该方新制剂奠定一定基础.

参考文献

[1]孟涌生．真武汤的现代研究[J]．北京中医，2007，26(9): 628 －631．

[2]李景巍．真武汤加减治疗老年原发性高血压病40例[J]．河南中医，2009，29(7): 640－641．

[3]刘崇新．真武汤化裁治疗上呼吸道感染后久咳138例[J]．安徽中医临床杂志，2000，12(2): 82．

[4]荆世常．真武汤加减治疗老年性遗尿95例[J]．河南中医，2011，31(1): 14．

[5]何幼斌．真武汤治疗尿路结石并肾积水30例[J]．湖北中医杂志，2003，25(4): 35．

[6]张萍，廖正根，梁新丽，等．均匀设计优选舒胸片处方药材的微波辅助提取工艺的研究[J]．中草药，2009，40(1): 45－49．

[7]欧阳丽娜，李兰林，吴雪，等．正交设计优选竹节参总皂苷微波提取工艺的研究[J]．中草药，2010，41(10): 1639－1642．

[8]龚盛昭，程江，杨卓如．微波场协同提取芦丁[J]．精细化工，2003，20(12): 758－760．

[9]丁晓兰，袁媛，赵志梅．韩冰教授谈真武汤之君药[J]．吉林中医药，2013，33(11): 1151－1152．

收稿日期:( 2014. 12. 18)

【文章编号】1007－8517(2015)06－0008－02

【文献标志码】A

【中图分类号】R284. 2