调节性T细胞过继回输在移植免疫耐受诱导中的临床应用研究

白纯 董红锰 李先亮 贺强

·综述·

调节性T细胞过继回输在移植免疫耐受诱导中的临床应用研究

白纯 董红锰 李先亮 贺强

调节性细胞在器官移植的排斥反应和自身免疫性疾病发生发展中起到重要作用。调节性T细胞的过继回输治疗，能够维持免疫细胞的平衡，提供供体特异的免疫调节作用，达到很好的临床治疗效果。实体器官移植的调节性细胞治疗，在动物研究中，已经得到很好的验证，临床应用前景巨大。但是在临床的试验中，还有很多亟待解决的问题。新的理论突破，比如免疫互噬理论和免疫嵌合等理论能够给临床调节性细胞的应用带来新思路。

肝移植； T淋巴细胞, 调节性； 组织疗法； 免疫耐受

近几年对于免疫机制的研究提示，可以利用调节性细胞机理诱导移植物免疫耐受并长期存活，这种自然免疫调节机制称为调节性细胞介导的免疫耐受。调节性细胞介导的免疫耐受可以在不使用免疫抑制剂情况下诱导移植物长期的存活。目前了解到的调节性细胞有调节性T细胞、调节性B细胞和调节性DC细胞等[1]，在T细胞中又分为CD8+和CD4+的调节性细胞[2]，而其中研究最多的是CD4+的T细胞，其表达的CD25和FOXP3作为区分标志，这群细胞称做CD4+调节性T细胞[3]。目前的研究表明这类细胞的失衡和功能的改变，直接影响临床疾病的发生发展和转归，并且可能在某些领域疾病的治疗中起到重要作用。

早期的研究结果提示调节性T细胞在临床疾病中有如下主要作用，一方面在正常体内免疫稳态中可以抑制过度的免疫反应，从而减少自身免疫疾病发生。文献报道内分泌失调性肠病-X染色体连锁综合征，是由于调节性T细胞的FOXP3基因沉默所引起的[4-5]；在早产儿的坏死性小肠炎的发病机制主要是由于FOXP3转录基因的沉默造成CD4/ CD8效应细胞的比例失衡破坏免疫系统[6]；在自发性免疫性肝炎的研究中，耗竭调节性T细胞使肝脏的炎症加重，正常情况下CD4+调节性T细胞可以介导自免肝的免疫耐受，延缓肝脏损伤的同时防止其它感染性损伤的发生[7]。如上所述在动物、人体体内调节性T细胞的缺乏都会造成自身免疫疾病。另一方面调节性T细胞可以缓解移植物抗宿主病。在造血干细胞移植同时回输调节性T细胞可以很好减小移植后患者的近期和远期排斥几率，并减少化疗药所造成的肿瘤再发等问题[8]。如上所述，这些成果促进调节性T细胞在实体器官领域临床的研究和应用的开展。

一、调节性T细胞治疗移植领域中的应用

调节性T细胞作为一种治疗手段在几十年前出现[9]，但现在面临的挑战还很严峻。Lee等[10]通过小鼠骨髓移

植模型证明了过继回输调节性T细胞可以有效的防止移植物抗宿主病的发生或延缓病程的进展，而用单一的抑制性细胞因子治疗不能达到相同的效果[11]。Richards等[12]结合荧光免疫显像技术发现调节性T细胞由胸腺产生，然后迁移到外周，如组织、皮肤、粘膜等处，在迁移过程中其数量会与局部炎症反应相关，局部炎症反应轻时其数量会很低。Liu等[13]在移植皮肤后使用重组人IL-10给予治疗可以介导局部皮肤免疫排斥反应的延迟发生，其发生机制可能与CD4+CD25+的T细胞有关。为了确定CD25+的T细胞能否用于细胞治疗，Hara等[14]团队在CBA小鼠体内移植入B10小鼠的心脏，然后再移植供体同系的皮肤到接受心脏移植的CBA小鼠，仅回输效应性细胞，看到了移植皮肤的急性排斥反应，而同时回输CD4+CD25+T细胞的一组，有80﹪的个体没有出现移植皮肤的急性排斥反应。可见调节性T细胞在移植物免疫耐受中起到了重要的作用。

2011年Di Ianni等[15]进行半相合造血干细胞移植病例的对照研究。参与实验的28例白血病患者，回输半相合供者提供的CD4+CD25+调节性T细胞。在后续的研究中实验组患者未给予任何预防移植物抗宿主疾病的预防措施。在12个月的中位随访时间中，与对照组相比该组患者的移植物抗宿主病表现比较缓和。此外与前期的临床数据相比，在移植后免疫力可以及时恢复，尤其是T细胞介导的免疫反应的恢复减少了各种机会性感染。

Brunstein等[16]使用了体外扩增并激活的脐带血产生的调节性T细胞进行了血液恶性肿瘤的临床治疗试验。对照组给予麦考酚吗乙酯和环孢素，实验组给予麦考酚吗乙酯和西罗莫司[17-18]化疗方案加调节性T细胞。在大约12个月的随访中，接受调节性T细胞回输治疗的患者中表现出近似无白血病的生存状态，与历史对照组相比观察期内疾病复燃率几乎为零。从以上临床试验来看，调节性T细胞的回输对于治疗慢性移植物抗宿主病具有良好的效果，但其远期效果还需要进一步的随访来证明。

以上的临床实验都是针对血液疾病进行的外周血中的调节性T细胞实验，而对于实体器官移植后回输调节性T细胞在移植器官局部的免疫反应情况目前还不是很明确。

1989年Hall等[19]发表的一个研究中提到了调节性细胞在实体器官移植物中的分布，研究者给予PVG到DV大鼠心脏移植模型应用两周环孢素，诱导出了大鼠长期的移植心免疫耐受，模型表现出了一种对于供体移植物非特异性的免疫耐受，对于第三方皮肤移植物其排斥作用依然很剧烈，但对于供者来源的移植皮肤表现出了长期的免疫耐受，并在移植物中发现了“W3/25+”的T细胞，这些细胞分布在幼稚的淋巴组织中。而且Hall还发现这种非特异性的免疫抑制状态和环孢素没有关系。Shimon等[20]提出了这群CD4+的调节性T细胞以CD25+作为标记。Köksoy等[21]团队在心脏移植模型中发现，在耐受动物外周血和脾脏中CD4+CD25+T细胞的含量要比排斥组的高并且血液中IL-10含量明显升高，而IL-10是一种起负性调节的细胞因子。

国内学者在诱导排斥的肝移植模型大鼠中发现，在肝移植排斥过程中CD8+调节性T细胞在局部组织中占的比例要比CD4+调节性T 细胞高，很有可能其诱导免疫耐受的能力要比CD4+调节性T细胞强[22]。这些实体器官移植基础的研究成果给调节性T细胞在临床上的应用提供了很好的证据。

二、第一个实体器官移植的临床试验：The one study

如何在实体器官移植中，发挥出调节性细胞治疗的作用，诱导免疫耐受，是一个非常具有挑战的课题。2011年李先亮[23]在法国南特提出，通过调节性细胞过继回输，重塑受体免疫调节机制，诱导免疫耐受的理念，并在大鼠的心脏移植模型中进行了验证。通过放射清髓后，过继回输免疫耐受性的CD8+调节性细胞可以诱导心脏移植受体免疫耐受。本研究也发现在移植免疫耐受的大鼠体内，移植物和脾脏是主要的调节性细胞聚集地，骨髓在脾切除后可以代替脾脏的作用，成为调节性细胞产生和聚集的地方[23]。这些研究成果为临床应用开展奠定一些基础。其它研究中心也发现调节性细胞过继回输在动物模型中，取得了巨大的成功，但是如何走向临床，还需要更多的研究和验证。

调节性T细胞治疗面向临床时会涉及到如下问题，一方面是用于治疗细胞的纯化和扩增方法，另一方面是治疗的有效性和安全性的评估[24]。多克隆的纯化和扩增调节性细胞在动物实验和临床上都可以实现[25-26]，而在治疗过程中的有效性和安全性尚缺合适的评估标准。为了更好的评估调节性细胞在实体器官移植领域的应用的有效性和安全性，实现细胞治疗的产业化生产，以法国南特器官移植中心和德国Rosenberg移植中心牵头，在欧洲开展器官移植领域第一个调节性细胞的临床试验研究：The One Study[27]。

该项目是基于基础和临床的多中心的联合研究，旨在找出合适的用于实体器官移植的调节性细胞，以及可靠的评估标准用于移植后调节细胞治疗有效性和安全性评估，以便于形成统一的临床治疗方案。该研究的一个报道使用异基因B细胞库来扩增同种特异性的自然调节性T细胞[28]，作为调节性细胞的扩增办法。虽然该项目有其它不同的用于治疗的调节性细胞的报道，但是在有效性和安全性方面没有形成共识。该研究的最终临床结果，可能会带来突破性的进展，但是从目前的进展来说，还是谨慎的乐观。因为开展调节性细胞治疗的工作，还有许多问题需要解答。

三、调节性细胞临床上应用面临的问题

（一）调节性细胞和免疫抑制剂的关系

调节性细胞治疗的出现以及在造血干细胞领域的应用，使其在实体器官移植领域看到了希望。目前的临床实验结果表明调节性T细胞与传统的免疫抑制药相比有明显的优势。短期临床随访结果比单用免疫抑制剂要好，Brunstein

等[16]在造血干细胞移植领域的调节性T细胞治疗研究显示出了良好的结果，评估调节性细胞治疗的安全性问题还得进行Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期临床实验。

目前临床上主要采用免疫抑制药和生物制剂（主要是单克隆抗体）来达到器官移植患者免疫抑制的目的。免疫抑制药的使用会使外周血的白细胞和淋巴细胞不同程度下降，部分药物会导致调节性T细胞下降，但也有部分药不会影响调节性细胞，这也许是体内免疫稳态平衡重调的一个良好契机[29]。

在具体免疫抑制药对于调节性T细胞的研究方面，调节性T细胞回输治疗的药物代谢学研究提示他克莫司会影响到调节性T细胞特别是CD25+FOXP3+细胞的FOXP3表型的表达，使过继回输的调节性细胞半衰期缩短，但不影响CD25+表型的表达。雷帕霉素可以增加回输调节性T细胞的半衰期，CD25+FOXP3+表型可以稳定存在，在回输后60 d仍然可以检测到标记的过继回输调节性T细胞。在调节性细胞过继回输治疗时合理的使用免疫抑制药可以最大程度的保证调节细胞的治疗量效果，减少由于急、慢性排斥反应造成的不良反应和对于过继回输的调节性T细胞的过度抑制[30]，其它的免疫抑制对于调节性T细胞的影响有待进一步研究。在动物实验方面，Rifai等[34]观察到过继传输调节性细胞，如果数量足够，一次回输，不需要免疫抑制剂，就可以顺利诱导免疫耐受。但是在临床上，还缺少有效的观察结果和评估有效性的手段，考虑到临床器官排斥的危险后果，联合不影响调节性细胞的免疫抑制剂，然后逐渐减量，调节性细胞分次回输，逐渐增加剂量，可能是合理的选择。

单克隆抗体针对细胞表面受体的阻滞是特异的，可以特异性的阻滞参与排斥反应有关的目的细胞，但其介导的免疫耐受是非供体特异性的，会产生其他副作用。虽然目前采用的调节性细胞都是多克隆的调节性细胞[23]，相应产生的免疫抑制是广泛但具有供体特异性的，对于器官移植或者是干细胞移植方面，由于移植物是细胞或组织级别的，其产生的免疫排斥反应是受体免疫系统暴露在一系列抗原环境下产生的。所以应用供体特异性的多克隆调节性T细胞回输是可以实现免疫抑制的，相对免疫抑制剂而言，调节性细胞用于器官移植免疫耐受的治疗，免疫系统的各类细胞数是不会减少的，在不减少的情况下调节性T细胞比例是增高的。这对于造血干细胞移植和器官移植来说可以降低患者机会性感染和免疫抑制剂造成再发肿瘤的风险[15-16]。

（二）对于调节性T细胞治疗有效性的检测方法评估

研究者发现，T细胞在激活后数小时内表面标志物会持续表达[31]，如CD25、CD69、CD154，如上的发现都是基于流式细胞术对激活的调节性细胞介导的免疫抑制和激活的调节性细胞分析得出的结论。研究者发现在新鲜的标本中CD4+CD25+调节性细胞和CD4+CD25hiCD127low调节性细胞，在7 h有CD69、CD154在抑制性细胞表面分子表达，在96 h可在上清中分离。这些抑制分子表达的同时有IL-2和IFN-γ的参与，提示与调节性细胞诱导免疫耐受有关。在调节性细胞诱导免疫耐受的治疗时，如上的发现给评估治疗有效性提供了可能使用的检测方法，但需要更多的实验来验证。应用细胞标记技术可以观测到调节性T细胞在体内调节性细胞库中的比例及半衰期，可作为检测调节性细胞有效性的一个补充，同时需要继续研究其他敏感的检测方法。调节性细胞治疗的有效性还需要通过抗移植物抗体、移植物功能、移植物局部病理等化验检查全面评估。动物实验结果表明，过继回输的调节性细胞，会长期存在受体体内，可能诱导受体产生免疫耐受性的调节性细胞[32]。

（三）调节性细胞治疗的种类和机制

CD4+CD25+的调节性T细胞是目前临床Ⅰ期实验较多的调节性细胞，其实现免疫抑制的方式主要分两类，一类是非细胞接触方式，另一类是细胞接触方式[33]。非细胞接触抑制方式主要是通过分泌抑制性的细胞因子实现对效应T、B细胞的抑制，CD4+CD25+调节性T细胞可以分泌IL-4、IL-10、IL-35、TGF-β来实现其非接触抑制目的，但是在体内有很多细胞可以产生这样的细胞因子，而文献报道单使用细胞因子无法诱导免疫耐受[11]。除了释放抑制性细胞因子外，CD4+CD25+调节性T细胞还可以释放溶解细胞的物质颗粒酶A、颗粒酶B，配合补体破坏排斥反应的效应性T细胞，达到免疫抑制作用。CD4+CD25+调节性T细胞还可以通过细胞接触方式来实现其免疫抑制的功能，在抗原提呈细胞通过MHCⅡ分子提呈抗原肽到效应体细胞时供者特异性的CD4+CD25+调节性T细胞通过接触影响抗原提呈细胞的抗原提呈过程，阻止效应性T细胞激活扩增，同时可能会诱导免疫耐受性DC产生，但是缺乏临床试验的有利验证。

除了上述已经进入临床试验的CD4+调节性细胞外，也有其它调节性细胞介导免疫耐受的报道。有文献报道和其他中心研究发现在动物实验中可以观察到CD8+调节性细胞介导免疫耐受的现象[34]，而且在临床上一些长期存活的患者和自发性免疫耐受的患者外周血中，都观察到CD8+调节性细胞的存在和数量上的增加，其功能类似于CD4+CD25+T细胞[35]。通过腺病毒转录CD40 Ig移植物内注射，阻断CD40-CD40L信号通路，建立大鼠的心脏移植免疫耐受模型，该免疫耐受由CD8+调节性细胞介导，并可以过继传输给下一代受体。发现CD8调节性细胞的供体特异性的免疫抑制功能主要通过非成熟的pDCs介导，CD8调节性细胞是通过IFN-γ和IDO依赖的两种机制通过接触和非接触两种方式作用于CD4效应细胞实现其增殖和活化，来达到控制局部和系统的免疫反应，诱导免疫耐受[35]。临床的免疫耐受到底是由一种调节性细胞介导还是一个调节性细胞网络共同起作用，还需要更多的临床观察，根据如上发现推断不同的移植器官、不同的治疗诱导方案，会有不同的调节性细胞起到作用，因此除了CD4+调节性细胞外，CD8+调节性细

胞，调节性树突细胞都是应该关注的重要研究对象[36]。

（四）供体特异性的调节性细胞的鉴别和产生

调节性细胞有两种起源，一种是胸腺中自然产生的称做自然调节性T细胞，另一种是在局部适应性免疫反应环境中产生的称为诱导调节性T细胞[37]。前期研究发现，过继回输自然调节性T细胞并不能诱导免疫耐受预防急性排斥反应发生，仍然会导致移植物的失功能[14]。只有过继回输诱导后的免疫耐受性调节性细胞，才有可能导致免疫耐受的产生。

在动物实验方面前期实验针对CD8调节性细胞进行了系统的研究。发现在大鼠心脏移植模型中，CD8调节性细胞介导了免疫耐受的过继传输，MHCⅡ阳性表达是判定供体特异性CD8+调节性T细胞的表面标志。极少量正常活化的T细胞也可以高表达MHCⅡ抗原，一般比例在1﹪左右，甚至更低。但在大鼠心脏移植模型中，介导免疫耐受的CD8+调节性T细胞群中，有50﹪的CD8+调节性T细胞高表达MHCⅡ抗原，过继传输CD8+MHCⅡ+调节性T细胞可以诱导供体特异性的免疫耐受，而不是CD8+MHCⅡ-调节性T细胞，证明了MHCⅡ+是供体特异性调节性细胞的表面标记[38]。

进一步研究发现，免疫耐受个体内存在互噬作用的细胞，而且其互噬作用是发生在CD8调节性细胞和浆细胞源性树突细胞之间[39]。这类CD8调节性细胞高表达MHCⅡ抗原，过继传输MHCⅡ+的CD8调节性细胞，可以在下一代受体产生免疫耐受。体外细胞培养实验，也证实了CD8调节性细胞和pDCs之间可以发生互噬作用，产生具有新的功能CD8调节性细胞和pDCs。因此李先亮课题组提出了通过免疫细胞互噬作用，能够诱导免疫嵌合的调节性细胞，这也是免疫嵌合理论的进一步发展和深入[39]。目前正在体外诱导扩增这类发生互噬作用的CD8调节性细胞和pDCs，并过继传输给移植受体，期待能够在移植受体诱导免疫耐受。因此互噬作用也可能是未来临床诱导免疫耐受的新途径。

根据国内外基础实验和临床实验的结果以及本中心的发现，调节性细胞，尤其是CD4+和CD8+的调节性细胞在造血干细胞移植和实体器官移植方面有很重要的研究价值和临床应用前景。调节性细胞在移植术后患者体内介导免疫耐受，消除了传统免疫抑制剂对受体的副作用，如再发肿瘤、机会性感染以及继发的一系列心脑血管疾病及内分泌代谢疾病[40-42]，克服了单克隆抗体高度特异性的阻滞体内所有受体而带来不必要的对于表达受体的细胞的系统性阻滞[43-44]。调节性细胞介导的免疫耐受更温和、更特异、更符合临床需求。目前的实验数据表明调节性细胞治疗临床应用潜力很大，需要更加精心设计的临床实验来评估它的安全性以及制定相应的评估有效性标准。免疫互噬作用和免疫嵌合的调节性细胞等理论和实验研究，能够解决调节性细胞供体特异性和检测标志物的问题，为临床调节性细胞治疗带来更多的可行性。

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Clinical application of regulatory T cells infusion to induce transplant immune tolerance

BaiChun, Dong Hongmeng, Li Xianliang, He Qiang. Department of hepato-biliary-pancreatic surgery, Bei Jing Chao-Yang Hospital, the Capital Medical University, Bei Jing 100020, China

Regulatory cells play a critical role in onorgan transplantation and autoimmune disease. The regulatory T cells infusion therapy can maintain the balance of immune status, lead to specific immune regulation, and is effective in clinical settings. Animal experiments have demonstrated that the regulatory cells therapy could induce immune tolerance in solid organ transplantation. However, there are several questions to be answered and the clinical use of regulatory cell therapy is still limited. The breakthrough of new theories opens the possibility of clinical use of regulatory T cells, such as trogocytosis and chimeric tolerogenic regulatory cells.

Liver transplantation； T-Lymphocytes, regulatory； Tissue therapy；Immune tolerance

2016-05-23）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.05.008

国家自然基金面上项目（81571554，81273270，81041110，81471590）

100020 北京，首都医科大学附属北京朝阳医院肝胆胰腺外科

李先亮，Email：lixianliangbjcy@126.com

白纯,董红锰,李先亮,等. 调节性T细胞过继回输在移植免疫耐受诱导中的临床应用研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2016, 6(5):307-311.