BALB/3T3细胞电化学行为的研究①

刘慧东，李彦仪，蔡　雨，张义英，叶　彩，李锦莲，高洪福

(1. 黑龙江省开拓辐射技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 154001；2. 佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)



BALB/3T3细胞电化学行为的研究①

刘慧东1，李彦仪2，蔡雨2，张义英2，叶彩2，李锦莲2，高洪福2

(1. 黑龙江省开拓辐射技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 154001；2. 佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要:目的: 研究小鼠成纤维细胞(BALB/3T3)的电化学行为。方法：采用电化学循环伏安法对BALB/3T3细胞进行电化学测试。结果：BALB/3T3细胞裂解液出现两个信号峰，分别为0.66 V的黄嘌呤/鸟嘌呤混合信号峰，以及0.99 V的腺嘌呤/次黄嘌呤混合信号峰。在分泌时间为30 min时，BALB/3T3细胞分泌即达到平衡。结论： 采用电化学法可以检测到BALB/3T3细胞的两个电化学信号，此研究可为电化学检测细胞癌变提供理论数据。

关键词:小鼠成纤维细胞(BALB/3T3); 嘌呤；电化学

注：李彦仪，蔡雨为佳木斯大学在读本科生。

肿瘤严重威胁着人类的生命安全与生活质量[1~5]。上世纪以来，人们对肿瘤的防治有了不断深入的研究，其中研究正常细胞与肿瘤细胞的区别成为了一个重要的讨论课题，越来越多的受到国内外科研工作者的重视[6~12]。本文采用多壁碳纳米管及离子液体修饰玻碳电极对BALB/3T3细胞胞质中的活性物质进行检测，并讨论BALB/3T3细胞的外分泌能力，为肿瘤细胞的电化学检测奠定基础。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

HF90型二氧化碳培养箱 (上海力申科学仪器有限公司)；Olympus倒置荧光显微镜 (CKX41)；BSC-1000超洁净工作台 (苏净安泰)；Eppendorf AG型高速离心机 (德国)；DK-600B电热恒温水槽 (上海森信实验仪器有限公司)；CHI615E电化学工作站 (上海辰华仪器有限公司)3 mm玻碳电极 (上海辰华仪器有限公司)；小鼠成纤维细胞BALB/3T3 (上海细胞库)；DMEM培养基 (Gibco公司)；优级胎牛血清 (Gibco公司)；双抗(链霉素和青霉素) (Gibco公司)。所用水均为三次蒸馏水。除非特殊说明，所有试剂均为分析纯。

1.2电极的制备及电化学检测

量取酸化多壁碳纳米管5mg，离子液体100μL，置于玛瑙研钵中，研磨均匀，即得离子液体混合酸化碳纳米管浆料。将抛光处理过的玻碳电极表面均匀的涂抹上离子液体混合酸化碳纳米管浆料，即得到离子液体混合酸化多壁碳纳米管刮涂玻碳电极(MWNTs-IL/GCE)。实验采用三电极体系作为电化学测试系统，其中MWNTs-IL/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝为辅助电极。

1.3细胞的收集、裂解及检测

将生长状态良好且长满培养皿底的细胞经胰蛋白酶消化、吹打、离心(1000r·min-1，10min)后得细胞沉淀，所得细胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液冲洗3次，悬浮于适量的pH 7.4 PBS溶液中，在水浴50 ℃作用30min后进行常规电化学测定。

1.4不同分泌时间3T3细胞悬浮液的检测

随机选取生长状态良好的3T3细胞，收集，计数，在37 ℃水浴中恒温分泌，分泌时间分别为0、10、20、30、40、50 和60min时进行常规电化学检测。

2　结果与讨论

2.1BALB/3T3细胞裂解液的伏安行为

3T3细胞裂解液伏安曲线如图1所示。图1-a 为pH 7.4 PBS缓冲液中的伏安曲线，从图中可以看出，没有任何氧化峰出现；图1-b为四种嘌呤混合物的伏安曲线，图中出现了两个明显的氧化峰，峰Ⅰ(0.66 V)为黄嘌呤和鸟嘌呤的混合信号峰，峰Ⅱ(0.99 V)为一肩峰，是腺嘌呤和次黄嘌呤的混合信号峰。图1-c 为BALB/3T3细胞裂解液的电化学伏安曲线，图中在氧化电位为0.69 V(Ⅰ)和0.99 V(Ⅱ)处出现的两个明显的氧化峰与四种嘌呤混合样品的信号峰基本一致，由此可以得出，BALB/3T3细胞裂解液的电化学伏安曲线中，峰Ⅰ为黄嘌呤和鸟嘌呤的氧化峰，峰Ⅱ为腺嘌呤和次黄嘌呤的氧化峰。

图1　BALB/3T3细胞裂解液循环伏安图

(a) pH 7.4 PBS缓冲液；(b) 黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤和次黄嘌呤混合溶液；(c) BALB/3T3细胞裂解液，细胞浓度：1×106cells·mL-1

2.2不同分泌时间BALB/3T3细胞悬浮液的伏安行为检测

图2为不同分泌时间3T3细胞悬浮液的峰电流变化。在0 ~ 30min内，PeakⅠ与PeakⅡ的峰电流均随时间的增加而上升，30 min之后，峰电流几乎不再随时间发生变化。说明30 min之后细胞外分泌达到平衡，细胞外液中嘌呤含量不再随时间发生变化。

图2　BALB/3T3细胞悬液峰电流随分泌时间变化曲线

3　结论

采用多壁碳纳米管及离子液体修饰玻碳电极对BALB/3T3细胞胞质中的活性物质进行检测，得到两个混合电化学信号，分别为0.66 V的黄嘌呤和鸟嘌呤混合信号峰，以及0.99 V的腺嘌呤和次黄嘌呤混合信号峰。对3T3细胞外分泌检测发现，在分泌时间为30 min时，细胞分泌即达到平衡。

参考文献:

[1]何泽涌. 从分子水平看细胞肿瘤化 [J]. 山西医药, 1981, 10 (2): 42-45

[2]刘培南. 肿瘤中核酸的含量及其代谢 [J]. 北京大学学报, 1959, S1: 99-121

[3]Bennett LL, Jr, Howard ES, et al. Searches for exploitable biochemical differences between normal and cancer cells: I. Nucleic acid purine metabolism in animal neoplasms [J]. Cancer Rearch, 1955, 15: 485-491

[4]Christine ES, Generosa G, Paul FE. Chemoprevention of cancer [J]. Current Problems in Cancer,1994,18 (1): 6-79

[5]潘世成. 肿瘤 [M]. 北京: 人民卫生出版社, 1984：663-703

[6]欧阳高亮, 李祺福, 洪水根. 细胞凋亡与肿瘤的发生发展和治疗 [J].国外医学肿瘤学分册，2000, 27 (5): 266-268

[7]Eric RF, Bert V. A genetic model for colorectal tumorigenesis [J].Cell,1990,61 (5): 759-767

[8]Pelayo C. Human gastric carcinogenesis: A multistep and multifactorial process-first American cancer society award lecture on cancer epidemiology and prevention [J]. Cancer Rearch, 1992, 52: 6735-6740

[9]陈骅,黄强,董军,等.肿瘤起源细胞学说与争论[J].肿瘤,2006,25(6):779-784

[10]何忻,陈静波,郑国庚,等.嘌呤检测的研究进展 [J].食品研究与开发, 2010, 31 (8): 199-202

[11]Vree TB, Riemens L, Koopman PM. High-performance liquid chromatography of xanthines-Effects of N-methyl and C-8 hydroxyl substitution on the retention times [J]. Journal of Chromatography, 1988, 428: 311-319

[12]Masatoki K, Yoshifumi M, Shimokawa K, et a1. Simultaneous determination of six adenyl purines in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence derivatization [J]. Journal of Chromatography B, 2001, 760: 159-163

Study of the electrochemical behavior of BALB/3T3 cell

LIUHui-Dong1,LIYan-yi2,CAIYu2,ZHANGYi-ying2,YECai2,LIJin-lian2,GAOHong-fu2

(1.Technology Development Company of Deploitation and Radiation of Heilongjiang Province, Harbin 154001, China; 2. College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract:Objective: To study The electrochemical behavior of BALB/3T3 celld. Methods: The Cyclic voltammetry method was used for studying the electrochemical behavior of BALB/3T3 cells. Results: Two anodic peak of BALB/3T3 cell cytoplasm were detected on 0.66 V (xanthine/guanine) and 0.99 V (adenine/hypoxanthine). Exocrine of BALB/3T3 cells reach equilibrium at 30 min. Conclusion: Two electrochemical signal of BALB/3T3 cells could be detected. The study could provide essential data for electrochemistry detection of cancer.

Key words:mouse fibroblasts cell (BALB/3T3); Purine; electrochemistry

中图分类号:R965.2

文献标识码:A

文章编号：1008-0104(2015)06-0029-02

基金项目：①1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：D00-54；2.佳木斯大学博士专项基金项目，编号：22Zb201514。

作者简介：刘慧东(1969～)女，黑龙江哈尔滨人，大专，工程师。

通讯作者：高洪福(1967～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，讲师。E-mail:Gaohongfu1967@163.com。

(收稿日期：2015-09-10)