不同方法在强直性脊柱炎患者HLA-B27检测中的比较

张世坤

不同方法在强直性脊柱炎患者HLA-B27检测中的比较

张世坤

目的探讨聚合酶链式反应-直接测序(PCR-SBT)法与磁珠酶联免疫吸附剂测定(IMSELISA)法检测人类白细胞抗原B27(HLA-B27)在强直性脊柱炎(AS)患者临床诊断中的价值。方法采用上述两种方法对150例AS患者进行外周静脉血HLA-B27检测,比较两种方法检测HLA-B27阳性率等。结果PCR-SBT的HLA-B27阳性检出率为49.33%(74/150),而IMS-ELISA的HLA-B27阳性检出率为36.67% (55/150),两种检测方法阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=5.36,P=0.027＜0.05)。结论PCR-SBT法更适合用于AS患者的临床诊断。

聚合酶链式反应-直接测序法；磁珠酶联免疫吸附剂测定法；人类白细胞抗原B27；强直性脊柱炎

HLA-B27是人体白细胞抗原HLA-B位点之中的一个位点［1］。HLA是人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的表达产物,在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应,调节免疫应答的功能,其中HLA-B属于Ⅰ型MHC基因表达的抗原［2］。有研究发现［3］HLA-B27表达与强直性脊柱炎高度相关,而强直性脊柱炎的发生率与HLA-B27的阳性表达率呈正相关,90%以上的强直性脊柱炎患者的HLA-B27抗原呈阳性表达。本文比较不同检测方法在强直性脊柱炎诊断中的具体临床意义,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年4月～2016年2月本院接诊150例AS门诊及住院患者,AS患者的诊断均符合美国风湿病协会(ACR)制定的最新的AS的分类和诊断标准［4］。其中男121例,女29例,年龄15～53岁,平均年龄(39.2±16.7)岁。

1.2 方法 所选研究对象均空腹采集外周静脉血(空腹＞10 h) 4ml,采用紫色EDTA无抗凝管。然后分别用PCR-SBT法与IMS-ELISA法对患者外周血HLA-B27的表达和基因进行检测,并比较两种方法的阳性率、敏感度和特异性等。

1.2.1 仪器设备与试剂 采用美国Molecular Devices公司生产的多功能酶标仪SpectraMaxM5/M5e,上海求精生化试剂仪器有限公司生产的高精度微量移液器,日本日立公司生产的U-2001紫外分光光度仪,德国Eppendorf公司生产的PCR仪,北京六一实验仪器厂生产的DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪以及美国伯乐公司生产的Gel Doc XR凝胶成像分析仪。试剂分别采用贝克曼库尔特有限公司生产的HLA-B27磁酶联免疫法检测试剂盒,上海吉玛制药技术有限公司生产的TRNzolA＋总RNA提取试剂、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、MarkerⅠ。

1.2.2 外周血HLA-B27基因表达检测 严格按照PCR-SBT法检测外周血HLA-B27的试剂盒说明书进行操作,①先用微量移液器取250 μl EDTA抗凝的外周血进行总RNA的提取,用分光光度计测定并调RNA浓度(ng/μl),并将总RNA提取液保存于-80℃备用。②将总RNA反转录成cDNA,然后进行PCR扩增,引物设计由上海sangong公司完成,上游引物：5'-GGTCCAAGACGAGGAGGTTC-3',下游引物：5'-CGTGGGACAGGAGGAATTAG-3',预期目的扩增片段长度为177 bp。③待PCR扩增结束后,用微量移液器取5 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。④用凝胶成像系统分析扩增产物的目的片段是否在目标位置。⑤取PCR结果进行测序。

1.2.3 外周血HLA-B27检测 严格按照IMS-ELISA法检测外周血HLA-B27的试剂盒使用说明书进行操作,加稀释过的CD45-HRPO结合体50 μl于微孔中,再分别加阴阳对照及血样各50 μl于微孔中,室温下孵育10min,然后洗板5次,再加显色液,用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值,OD值＜0.4者为HLA-B27抗原检测阴性,OD值≥0.4者为HLA-B27抗原检测阳性［5］。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；敏感度和特异性采用ROC曲线分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

150例研究对象中,PCR-SBT法的HLA-B27阳性检出率为49.33%(74/150),而IMS-ELISA法的HLA-B27阳性检出率为36.67%(55/150),两种检测阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=5.36,P=0.027＜0.05)。PCR-SBT法检测AS的敏感度和特异性分别为97.33%和96.67%,而IMS-ELISA法检测AS的敏感度和特异性分别为69.67%和76.33%,两种方法的ROC曲线下面积分别为0.952和0.816,说明PCR-SBT法在检测HLA-B27及诊断AS方面的价值高于IMS-ELISA。

3 讨论

1963年美国风湿病学会(ARA)将AS与类风湿关节炎疾病区分开,以AS来代替原来的类风湿性脊柱炎。AS可累及任何关节,但以脊柱关节受累为多,发病年龄多为15～30岁且男性居多,一般情况下男女比例为10:1左右,目前对于男女AS患病率的差异尚无确切解释。目前关于AS的发病机理及病因尚未完全阐明,虽然有可能与遗传、感染、免疫、环境等因素有关,但尚无确切解释。HLA-B27在AS的整个发生发展过程中都起着一定的作用,HLA-B27与AS在遗传上具有很强的关联性。HLA-B27检测结果显示阳性的AS患者,其强直性脊柱炎的临床症状及体征要比HLA-B27检测结果显示阴性的AS患者出现的早,因此探索更加敏感及具有特异性的HLA-B27检测方法对于AS的早期诊断及早期治疗具有很重要的意义。本研究显示PCR-SBT法阳性检出率更高,说明其更适合用于AS患者临床诊断。

［1］洪俊,张平安,李艳.强直性脊柱炎患者人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比.检验医学,2006,21(1):1-4.

［2］王佳佳.HCV基因型分布及HLA-DP基因多态性与高危人群HCV感染转归的关系.南京医科大学,2014.

［3］吴丽娟,李茂圆,刘霞.外周血淋巴细胞HLA-B27表达强度与强直性脊柱炎临床分期的关系.检验医学与临床,2014(21): 2971-2973.

［4］Raychaudhuri SP,Deodhar A.The classification and diagnostic criteria of ankylosing spondylitis.Journal of Autoimmunity,2014,48(2):128-133.

［5］王平均,孙灵迪,梅传忠.聚合酶链反应-直接测序法在强直性脊柱炎患者 HLA-B27检测中的应用.中国实验诊断学,2015(11): 1898-1900.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.13.022

2016-04-11］

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