伪狂犬病毒 （PRV）间接ELISA试验

张苗苗 唐桂佳

（1，湖北生物科技职业学院 430070；2，武汉科前动物生物制品有限责任公司 430070）

伪狂犬病毒 （PRV）间接ELISA试验

张苗苗1，2唐桂佳1，2

（1，湖北生物科技职业学院 430070；2，武汉科前动物生物制品有限责任公司 430070）

将PRVHB98株接种IB细胞，通过超声波破碎后利用蔗糖梯度离心纯化病毒作为ELISA抗原，配以HRP标记的酶标记物、TMB显色液、终止液组成PRV间接ELISA。对PRV间接ELISA各操作步骤进行试验，通过试验数据，确定ELISA的最佳操作方法。

猪；PRV；ELISA；蔗糖梯度离心；试验

猪为六畜之首。养猪业在世界尤其是中国国民经济中占有重要地位。近年来。猪肉在肉类产品结构中的比重一直保持在三分之一左右。是世界人民喜爱的肉食品之一[1]。但是各种疾病也为养猪业带来了不小的损失。其中包括伪狂犬病毒。新生仔猪感染伪狂犬病毒会引起大量死亡。怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎[2]。公猪感染伪狂犬病毒（Pseudorabies virus。PRV）后。表现为睾丸肿胀、萎缩[3]。通过鉴别诊断可以确定猪群是否感染有PRV。可以淘汰感染猪群。最终建立新的无病猪群。

1 材料与方法

1.1 试验用病毒毒株

武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的HB98株。

1.2 主要试剂

牛血清白蛋白 （BSA）：西德进口分装。

PRV-gB抗体检测试剂盒：美国IDEXX公司生产。

PRV-gB阳性参考血清：武汉科前动物生物制品有限公司提供。

PRV-gB阴性参考血清：武汉科前动物生物制品有限公司提供。

TMB显色液：武汉科前动物生物制品有限公司提供。

羊抗猪酶标二抗：SBA公司生产。

1.3 主要试验器材

96孔酶标板：深圳金灿华有限责任公司生产。

MK3型酶标仪：Thermo生产。

7520型分光光度计：上海分析仪器厂生产。

1.4 包被抗原的制备

将PRVHB98株 （效价106.8TCID50/ml）接种IB细胞。37℃孵育24h后。细胞病变达到100%时。及时收获病毒。病毒液经三次超声波裂解1min（20KC/S）后。再于4℃8000r/min离心20min。弃上清。沉淀用原体积的1/20的0.01mol/L。pH7.2PBS悬浮。经充分悬浮的病毒液27000r/min超速离心取沉淀用1ml左右TE液悬浮。依次加入60%、45%、35%、20%蔗糖溶液。最上层加入重悬的病毒液27000r/min进行蔗糖梯度离心。收集各层之间的液体分别用TE27000r/min离心脱糖后PBS重悬。分装-70℃冻存。用分光光度计测量OD260和OD280。运用公式蛋白浓度=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数。取含量最高的为ELISA抗原[4]。

1.5 最佳反应条件

1.5.1 抗原和血清稀释度的确定

用0.05mol/L pH=9.6碳酸盐缓冲液将PRV抗原按1：1000、 1： 2000、 1： 4000、 1： 8000、 1： 16000、 1： 32000、1：64000、1：128000稀释。分别加入到96孔酶标板左侧第1～12列的第 1～8行。 每孔 100μl。 37℃作用 1h后置 2～8℃过夜[5]。取出弃去孔中溶液后。每孔加入120μl封闭液。37℃作用1h。弃孔内封闭液；用血清稀释液将PRV-gB阳性血清和阴性血清在酶标板横向上1～6行和7～12行作1：10、1：20、 1： 40、 1： 80、 1： 160、 1： 320 倍比稀释后。 进行ELISA检测。测定各稀释度OD630nm值。计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清孔之间的OD630nm值的比值 （P/N值）。选择P/N值最大孔的稀释倍数作为抗原和血清的最佳稀释度[6]。

1.5.2 酶标记物反应时间的确定

将酶标记物按1：5000稀释后。37℃分别作用15min、30min、45min及60min。进行ELISA检测。确定酶标抗体的最佳反应时间[7]。

1.5.3 底物的最佳反应时间的确定

加入底物后 37℃分别反应 5min、10min、15min及30min。进行ELISA检测。确定底物的最佳反应时间。

2 结果

2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

采取方阵滴定的方法来确定。试验结果表明抗原最佳包被浓度为1：4000。血清最佳稀释度为1：40。

2.2 封闭液的确定

（1）含0.1%脱脂乳、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

（2）含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

（3）含1%脱脂乳、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

（4）含5%脱脂乳、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液作为封闭液。进行ELISA检测。确定最适合的封闭液为含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

2.3 样品稀释液的确定

（1）含0.1%脱脂乳、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

（2）含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

（3）含1%脱脂乳、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

（4）含5%脱脂乳、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液作为血清稀释液。进行ELISA检测。确定最适合的稀释液为含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液。

2.4 血清最佳反应条件的确定

加入待检血清后。分别于 37℃作用 15min、30min、45min、60min。进行ELISA检测。确定血清的最佳反应条件为37℃30min。

2.5 酶标抗体反应条件的确定

将酶标抗体作1：5000稀释后。37℃分别作用15min、30min、45min、60min。进行ELISA检测。确定酶标二抗的最佳反应条件为37℃30min。

2.6 底物的最佳反应条件的确定

加入底物后 37℃分别反应 5min、10min、15min及30min。进行ELISA检测。确定底物的最佳反应条件为37℃10min。

2.7 包被程序

用pH值9.6的0.05mo1/L碳酸盐缓冲液稀释抗原至工作浓度 （1： 80）。 100μl/孔包被酶标板。 2～8℃包被过夜 （14～18h）。甩干。加入含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液封闭37℃1h。甩干。加入保护剂37℃2h。2～8℃保存。

2.8 ELISA操作程序

（1）用pH值9.6的0.05mo1/L碳酸盐缓冲液稀释抗原至工作浓度。100μl/孔包被板。37℃作用1h后。2～8℃包被过夜。甩干。

（2）加封闭液。120μl/孔。37℃作用1h。甩干。

（3） 加入保护剂。 120μl/孔。 37℃作用 1h 后。 2～8℃过夜。甩干。37℃烘干2h。

（4） 加入 1： 40稀释的待检血清。 100μl/孔。 37℃。30min。洗涤液洗板3次。每次3min。

（5）加入1：5000稀释的酶标抗体。100μl/孔。37℃。30min。洗涤液洗板5次。每次3min。

（6）加入底物液A、B。各加50μl/孔。室温避光显色10min。

（7）加终止液50μl/孔终止反应。酶联免疫检测仪测OD450。

3 小结

本病尚无特效治疗药物。紧急情况下。用高免血清治疗。可降低死亡率。疫苗免疫接种是预防和控制伪狂犬病的根本措施。目前国内外已研制成功伪狂犬的常规弱毒疫苗、灭活疫苗以及基因缺失疫苗 （包括基因缺失弱毒苗和灭活苗）。这些疫苗都能有效地减轻或防止伪狂犬病的临诊症状。从而减少该病造成的经济损失。消灭牧场中的鼠类。对预防本病有重要意义[8]。同时。还要严格控制犬、猫、鸟类和其他禽类进入猪场。严格控制人员来往。并做好消毒工作及血清学监测等。这样对本病的防制也可起到积极的推动作用。

[1]程晶,陈艳红,荫硕焱,等.2006～2008年我国部分地区规模化猪场PRV血清流行病学调查[J].中国动物传染病学报,2009,17（1）:67-71.

[2]刘有昌,金萍,康立平,等.种猪群伪狂犬病野毒感染的监测[J].中国兽药杂志,2007(2):14-18.

[3]赵东升,刘有昌,安福生,等.近年来我国猪伪狂犬病的流行状况和分析[J].今日养猪业,2008(6):26-28.

[4]曹斌,谢献胜,等.间接ELISA快速检测猪PRV抗体方法的建立[J].畜牧与兽医,2007,39（2）:46-47.

[5]刘文兴.布鲁氏菌标记疫苗(M5-90-26)的鉴别诊断及其bp26蛋白的免疫原性分析.《南京农业大学博士论文》,2011.

[6]邱德新,陈焕春,何启盖,等.间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体[J].中国兽医学报,2002（2）:149-151.

[7]张德明,庄向生,许盛武,等.用VN、ELISA检测断乳后仔猪伪狂犬病毒抗体的动态变化[J].福建农业学报,2002,17（3）:172-173.

[8]陈焕春,金梅林,何启盖,等.猪伪狂犬病毒油乳剂灭火苗的制备及其安全性的和免疫原性的试验[J].畜牧兽医学报,2001,32（1）:44-51.

张苗苗 （1983-），女，汉族，湖北省武汉市人，硕士研究生，讲师，药理与毒理学专业，从事世界主要发达国家和国际组织兽药耐药性管理研究工作。