胶体金条在牛结核病防治中的应用

吕春华 何洵 漆月 舒展 黄杨波

（1，新疆维吾尔自治区阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心 836500；2，新疆维吾尔自治区动物卫生监督所 830011；3，广州悦洋生物技术有限公司 510300）

胶体金条在牛结核病防治中的应用

吕春华1何洵2漆月3舒展1黄杨波1

（1，新疆维吾尔自治区阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心 836500；2，新疆维吾尔自治区动物卫生监督所 830011；3，广州悦洋生物技术有限公司 510300）

牛结核病是一种由牛分枝杆菌引起的慢性、消耗性人兽共患病，世界动物卫生组织 （OIE）将牛结核病列入B类动物疫病，我国也在二类动物疫病中将其收录。该病对奶牛生产业造成巨大的经济损失，严重危害人类健康，威胁社会公共卫生安全。因此，科学防治牛结核病对于畜牧业发展、人类健康和公共卫生安全都具有重大意义。我们采用胶体金试纸条对该地区的牛群进行牛结核病检疫，及时扑杀阳性牛，积累了部分胶体金试纸条在牛结核病防治中的应用经验。

胶体金试纸条；牛结核病；防治

近年来结核病 （Tuberculosis）在人间的感染率上升。全国新发活动性肺结核病患者高达145万人。其中传染性肺结核患者65万人。约有13万人因此死亡[1]。研究证实有10%的人结核病是由牛分枝杆菌 （Mycobacterium Bovis。M.Bovis）引起的。世界动物卫生组织 （OIE）在第七次专家委员会报告中指出：在那些牛结核病 （Bovine Tuberculosis。bBT）的国家。除非扑灭牛结核病。否则人类结核病的控制就不能成功。目前随着国际贸易、动物及动物制品的市场流通和人们对奶制品需求量的增加。牛结核病必将得到养殖场和政府的高度重视。据不完全统计。全世界有5000万头牛感染了牛分枝杆菌。每年直接造成经济损失达30多亿美元[2]。

牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人兽共患病。该病临床症状与受害器官相对应。肺结核时病牛逐渐消瘦并伴有咳嗽和呼吸困难；乳房结核时乳房有肿块。产奶量减少或停止泌乳。且常波及乳房上淋巴结。严重者甚至乳腺萎缩或肿大、变硬；生殖器官结核时奶牛表现为屡配不孕和流产；肠结核时病牛食欲、消化和营养物质吸收紊乱。便秘和腹泻交替出现等[3-5]。

1 牛结核病的诊断方法

牛感染牛分枝杆菌后的临床表现并不明显。所以很难依靠临床诊断鉴别出感染分枝结核杆菌的病牛。所以常需要用一些特殊的检测方法进行诊断。这不仅有利于确诊。更可查出隐性病牛。目前常用的诊断方法大体上可分为3类：细菌学检查方法、免疫学方法和分子生物学检测方法。由于细菌学和分子生物学的方法在目前都需要在实验室完成。且程序繁杂。时间较长。一般不常用。本文将介绍几种常用免疫学方法。

1.1 结核菌素皮内变态反应试验

结核菌素皮内变态反应试验 （Tuberculin skin test。TST）是OIE迄今为止唯一推荐的牛结核病的诊断方法。该方法主要是用牛结核菌素 （PPD）对牛进行皮内接种。于72～96h后观察接种部位肿胀程度。通过游标卡尺量皮厚的方法进行判定结果。该方法有很多弊端。首先是注射的PPD对牛个体反应有差异。结果判定靠检疫人员测量皮肤厚度。易造成人为误差。操作繁琐。费时费力。最大缺点是缺乏时效性；其次TST的试验结果假阳性率较高、非特异性高。但牛感染非致病性分枝杆菌或使用某些药物治疗就会造成假阳性结果。在相当数量的结核菌素试验阳性牛中。既找不出特征病变。又不能分离出结核菌。或仅仅分离出非典型的分枝杆菌。重复检疫时阳性率下降。而且妊娠母牛和细胞免疫反应低下的重症患牛检出率均很低；最后TST阳性仅能表明在过去某一时间曾经发生过的一次结核菌感染。它无法证明目前的结核菌感染是否为活动的。或仅为在机体的某处有活的结核菌存在[6。7]。综上原因使得该方法已成为基层检疫中捕杀政策难以执行及奶牛场难以净化的直接原因。因此有必要开展其他的辅助诊断。以更准确地判断结核病的感染情况。

1.2 酶联免疫吸附试验 （ELISA）

ELISA以其简单、方便、特异、敏感的特点深受广大科技工作者的喜欢。1976年Nassau首次将ELISA方法用于检测牛血清中牛结核病抗体。随后各国学者也陆续开始了牛结核病抗体检测ELISA方法的研究[8]。现在已有像韩国安捷（Bionote）公司生产的牛结核病抗体检测ELISA试剂盒出售。在牛结核病免疫学试验中。ELISA作为TST的补充试验对于鉴别阴性和假阴性反应具有重要作用。

1.3 γ-干扰素诊断法

牛在感染牛分枝杆菌后会产生致敏的淋巴细胞。当这些致敏细胞在体外受到结核菌素刺激后就会释放大量的γ-干扰素 （IFN-γ）。再通过ELISA方法检测这些特异的IFN-γ来判断牛是否感染牛结核。现也有商品化的试剂盒。因为IFN-γ诊断法的敏感性和特异性较高。能鉴别出早期感染牛分枝杆菌的牛。降低了传染的风险；所以许多国家已在2000年世界牛分枝杆菌会议后使用IFN-γ诊断法监测牛群。但IFN-γ诊断法最大的缺点是一般的基层实验室难以完成。只有在科研院所或大学教育机构作为科研项目才开展此项工作。进行时间也较长。完成难度也较大。

1.4 胶体金试纸条

胶体金试纸条是一种运用胶体金免疫层析 （Gold immunochromatography assay。GICA）技术来检测药物、毒品、激素、病原体及其抗体等物质的简单、便捷、特异、灵敏的检测工具。GICA技术是在胶体金技术、ELISA、免疫层析技术、单克隆抗体技术、乳胶凝集试验和新材料技术基础上发展起来的一种快速、敏感的免疫检测技术。该技术与继荧光标记技术、酶标记技术和放射性同位素标记技术一起成为了现在最重要的四大免疫标记技术[9]。以牛分枝杆菌特有的抗原蛋白作为捕获抗原的胶体金试纸条不仅拥有不亚于其它免疫学诊断方法的敏感性和特异性。还有比其它免疫学诊断方法操作更简单、耗时少的优点。深受广大基层兽医或养殖场的欢迎。笔者在使用了韩国安捷 （Bionote）公司的牛结核病抗体快速检测试剂盒进行了对牛群结核病的检疫。从中获得了不少检测牛结核病方面的经验教训。

2 应用胶体金试纸条检测牛结核病

牛结核病是我国政府要求必须 “检疫—扑杀”的动物疫病之一。但由于我国对扑杀病牛的财政补贴不高。造成养殖场自主承担损失比例偏高。所以不愿意配合检疫而出现不检或谎报、漏报的现象。再加之不同单位机构对牛结核病的流行病学调查的采样方式和检测方法不同的是我国牛结核病的流行现状数据不准确。但可以明确我国的牛结核病疫情是呈蔓延上升的。我国在牛结核病防治中主要存在以下几个问题：一是对牛结核病的防治和净化没有确切的政策规划。二是缺乏合理科学的防治手段或技术。三是畜牧行业从业人员的整体素质不高。四是早先的扑杀补贴标准低。不符合现在的市场行情。五是缺乏对牛群流动的有力监管及健全的牛群流动可追溯系统。六是对野生动物结核病的关注度不够[10]。

在实行 “检疫—扑杀”过程中。首先要解决的是如何快速、准确的诊断出牛结核病病牛。笔者在近些年开始。实施胶体金试纸条示范点检疫工作。选择三个县市的20个乡镇作为应用示范点。采用韩国安捷 （Bionote）公司的牛结核病抗体快速检测试剂盒对5496头牛进行了检测。检测结果见附表。

在实践中胶体金试纸条表现出了让基层兽医人员欣喜的性能。应用胶体金试纸条检测牛结核病抗体整个过程仅需几分钟。远远小于TST方法的72h。更不需要注射PPD后回访养殖场测量皮厚。省时省力。像阿勒泰地区这样每年要做上万头牛结核病检疫的养殖大区。若全部采用费时费力的TST方法进行牛结核病检疫。兽医检疫人员的工作就相当繁重。难免就会有人为造成的检疫结果误差、数据不准、谎报、漏报的现象等问题；此时。胶体金试纸条就是一个很好的解决问题的工具。

在试点进行胶体金试纸条检疫牛结核病的过程中也遇到了很多麻烦。比如养殖场人员和基层兽医对胶体金技术不了解。对试验准确性产生怀疑。所以我们在乡镇站对专业技术骨干进行培训。通过对基层技术人员的培训和农牧民的科普培训。在明确了胶体金试纸条对牛结核病的检测原理和实际效果后。我们还鼓励农牧民自己购买胶体金试纸条进行自家牛群的日常牛结核病监控。现在已有部分养殖场主在外地买牛时携带胶体金试纸条对欲购牛进行现场检测。确保自己的养殖场购买、引进健康牛群。

3 总结与讨论

我们在牛的结核病防治工作中应用胶体金试纸条作为检测工具。得到了积极的肯定。实践证明胶体金试纸条在牛结核病检测中比TST、IFN-γ诊断法、ELISA等方法更方便、更快捷、更适合于基层。我国在防治牛结核病中比较大的一个瓶颈问题就是缺乏有效的牛流通市场规范检疫体系。往往没有做好检疫工作。如果我们在购买、引进牛群过程中运用胶体金试纸条作为现场诊断工具。或许就能大大减少结核病牛的流通；相信这会成为一个防治牛结核病的有效方法。当然。胶体金试纸条并不是那么完美。前文已经介绍了胶体金试纸条的原理是依靠试纸条上的抗原蛋白去检测牛结核抗体。针对的是牛感染结核中后期的体液免疫阶段所产生的抗体；但在牛感染结核的前期。机体主要是以细胞免疫为主。此时胶体金试纸条就不一定能检测到抗体。而针对牛结核病早期感染的IFN-γ诊断法就是一个很好的补充。因此。在牛结核病防治中要将几种诊断方法以科学合理的方式结合起来。做到最快速、最准确的诊断。同时。政府应该出台有活力的符合市场规律的经济补偿政策。以便于及时发现阳性牛并扑杀；规范牛流动可追溯系统。杜绝病牛的随意流通。组织基层从业人员参加科普培训。增加基层兽医及养殖场人员的防病、防控意识。更重要的是要培养疫病检测意识、提高疫病检测意识。将政府为主的例行监测转变为养殖场自身的日常检测。

[1]吴位珩,孙启跃,等.浅谈奶牛场牛结核病的净化措施[J].上海畜牧兽医通讯,2012（4）:88.

[2]张书环.牛结核病胶体金免疫层析方法的建立与初步运用[D].武汉:华中农业大学,2007.

[3]蔡宝祥.家畜传染病[M].第4版.北京:中国农业大学,2001.

[4]王素坤.牛结核病的诊断及防制措施 [J].养殖技术顾问,2013（6）:89.

[5]陆承平.兽医微生物学[M].第3版.北京:中国农业出版社,2001.

[6]王振国,宋广文,等.吉林农业大学报,1998,20（2）:73-77.

[7]Palmer Mv W W T T.Effects of Different Tuberculin Skin-test Ingregimens on Gamma Interferon and Antibody Responses in Cattle Experimentally Infected with MyeobaeteriumBovis[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13（3）:387-394.

[8]张松柏,邱美珍,周望平,等.牛结核病诊断方法研究进展[J].中国奶牛,2010（1）:36-39.

[9]林彤,独军政,丛国正,等.胶体金标记免疫层析技术的最新应用进展[J].安徽农业科学,2010（16）:8429-8431.

[10]郭爱珍.我国牛结核病的防控与净化[J].兽医导刊,2010,156（8）:38-40.

吕春华 （1958-），男，农业推广研究员，长期从事动物疫病防控及新技术示范应用推广工作。