珍稀药用植物三叶青种质资源研究现状△

彭昕，吉庆勇，梁雅清，张煜炯，楼天灵

(1.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100；2.丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000)

珍稀药用植物三叶青种质资源研究现状△

彭昕1*，吉庆勇2，梁雅清1，张煜炯1，楼天灵1

(1.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100；2.丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000)

三叶青是珍稀中药材，临床应用广泛，其野生资源濒危，人工栽培难度大，品种选育落后，导致生产中种质退化，品系混杂，严重影响了临床用药的安全稳定。本文综述了近年来三叶青种质资源分类、繁育、保存、鉴定及评价等方面取得的研究进展，分析了目前其种质资源研究与利用中存在的问题，以期为三叶青产业的可持续发展提供参考。

三叶青；人工繁育；种质鉴定；资源评价

三叶青Tetrastigmahemsleyanum是我国浙江、江西等南方部分地区的珍稀药用植物品种。中文学名为三叶崖爬藤，又名金线吊葫芦，为葡萄科崖爬藤属植物，以地下块根或全草入药。是抗肿瘤常用药物，也具有抗炎、解热、护肝等作用[1-3]，是多种中成药(如华佗风痛宝胶囊、排石利胆胶囊、结石康胶囊、金丝地甲胶囊、金芪片等)的主要药味，也被开发成保健品。药理研究显示总黄酮、总氨基酸和多糖为其主要活性物质[3-5]。目前三叶青野生资源濒临灭绝，人工栽培难度大，其药用部位地下块根生长慢，需要3～5年才能达到商品药材的要求。2011年三叶青被列入“浙江省首批农作物种质资源保护名录”。不同产区、不同种质三叶青的外观性状(大叶/小叶，紫藤/青藤)、地下块根产量以及有效成份含量存在明显差异。由于资源稀缺而需求量大，伪混品众多，近年来杭州等地先后出现多起患者服用混入乌头子根的含三叶青饮片中药中毒事件。另一方面，三叶青种子产量少或无，且是多年生植物，有性繁殖慢，农家生产历来采用扦插等无性繁殖，只种不选，自繁自用的状况加重了性状退化，严重影响了临床疗效，因此资源保护开发与评价、品种选育是三叶青生产及应用上亟待解决的重要课题。笔者结合本课题组近年来的相关研究成果就三叶青种质资源分类、繁育、保存、鉴定及评价等方面取得的研究进展进行了总结和分析，以期为三叶青资源的进一步研究及开发利用提供参考。

1 种质资源研究现状

1.1 种质类型和产地分布

三叶青种质类型主要从叶片大小和形状、表面革质程度，叶边锯齿、藤颜色和形状上区分，一般大致分为紫藤和青藤两种[6]：青藤三叶青老藤的表面青白色，藤本较粗壮，叶片较大，块根个体较大，主要分布于我国湖南、福建、广西、云南的部分地区。紫藤三叶青新藤为绿色，一般2～3年后植株下部老藤逐渐变成紫色或褐色。藤本较细小，有棱角，叶片较小，块根多呈葫芦状，主要分布于浙江、江西等地。相比之下，青藤三叶青分布地域较广，生长旺盛，产量较高，数量较多。但一般认为青藤三叶青块根性寒，药用功效不及紫藤三叶青。

1.2 人工繁育技术

1.2.1 组培快繁 钟毓倩等[14]以三叶青茎尖、叶片及带腋芽的茎段为外植体，认为其诱导愈伤最佳的外植体为茎尖，并筛选出适合不定芽继代增殖的培养基及生根培养基类型。钱丽华[15]通过筛选比较愈伤诱导、增殖以及不定根诱导的主要影响因子，初步摸索了三叶青不定根扩繁的激素条件，为今后通过三叶青不定根培养工业化生产其药用活性成分奠定了技术基础。史清英[16]对三叶青茎段外植体组织培养体系进行了优化，并发现在其组培苗根部定殖印度梨形孢，可明显促进组培苗的生长发育，其株高和干鲜重都显著高于未接种的三叶青幼苗。杜苏瑞[17]利用发根农杆菌K599侵染三叶青实生苗或组培苗的叶片，成功诱导出转基因毛状根，为利用三叶青毛状根作为生物反应器大规模生产三叶青次生代谢物提供了理论依据和技术支撑。

本课题组在三叶青组培快繁[7-8]、悬浮细胞培养[9-10]及次级代谢调控[11-12]方面研究确定了促进愈伤组织生长、最利于黄酮积累的最佳培养基配方和培养条件，确定了通过腋芽增殖的三叶青快繁育苗技术[7-8]；比较了两种三叶青细胞悬浮体系中细胞增殖和总黄酮积累的动态，构建了增殖系数大，继代后性能稳定，总黄酮含量高于原植株的三叶青悬浮细胞系[9，12]。研究了稀土元素对三叶青悬浮细胞代谢相关酶活性及同工酶表达的影响，结果显示100 μM Ce3+和 Nd3+最有利于其生物量及黄酮的积累，50～200 μM稀土离子对CAT，POD，PAL，EST等酶表达情况有显著影响；稀土离子诱导生物量及黄酮积累的机理与其激发初生及次生代谢途径中关键酶的合成，诱发胁迫防御反应，提高细胞代谢水平有关[10]。通过对稀土离子的诱导效应和Ca2+信号通路的关系进行研究显示，在培养基中加入金属诱导子与降低钙离子浓度或增加钙离子阻断剂相结合的方式，能促进三叶青悬浮细胞增殖及提高其黄酮产量[11]。通过对继代多次的三叶青愈伤组织的遗传稳定性进行了考察，研究表明继代4次以内的愈伤组织遗传稳定，但继代次数增加，增加了DNA点突变和种性退化的机率，提出为避免保存的原始种质基因丢失，尽可能采用试管苗方式继代保存[13]的建议。

1.2.2 人工栽培 浦锦宝等[20]利用500 mg·L-1的生根粉溶液浸泡插穗的下切口，实现了人工繁育三叶青的目的。程良绥[21]从选地与整地、幼苗繁育、林下种植、林地管理、病虫害防治、块根采收等方面总结三叶青林下栽培技术。Dai[22]对在自然光照和不同程度遮荫处理条件下栽培30天的三叶青光合能力，叶绿素荧光性和叶绿素含量进行了比较研究，实验结果显示 67%的遮阴处理时三叶青苗叶子最大，且光合作用最强，为栽培三叶青提供了最佳光照条件的参考依据。

本课题组研究了生根剂、插穗年龄和基质对三叶青插穗生根的影响，显示2～3 年生老枝于1000 mg·L-1IBA 浸渍 10s 后扦插于黄土中生根效果最佳[18]。并收集11 个浙江、江西、湖南等产地三叶青种质资源，进行扦插试验，比较其农艺性状与生长特点，结果表明，不同种源三叶青插穗生长速度、新梢长、茎粗及叶长、叶宽均存在极显著差异 (P<0.01)[19]。本课题组负责的“珍稀药用植物三叶青资源收集及人工种植技术研究”、“三叶青经济林下套种关键栽培技术”分别于2013、2014年通过了浙江省科技成果鉴定。

1.3 种质鉴定

1.3.1 外部形态、显微结构或理化鉴别方法 由于三叶青野生资源濒临灭绝，药材市场上伪混品盛行，严重影响了其临床用药的安全性和有效性。李水福[23]从原植物形态、药材性状和显微鉴别三方面总结了三叶青与其常见伪品土圞儿的区别特征。殷红妹[24]通过性状观察、理化鉴别和高效液相色谱法成功鉴别了三叶青及其伪混品乌头。黄真[25]从药材外部性状、显微特征及一般理化鉴别等方面对浙江及广西产地的三叶青进行生药学鉴别，为三叶青药材品种鉴别提供了实验依据。

然而传统中药材外部形态、显微结构或理化鉴别方法由于产地粗加工和饮片炮制导致外部性状、显微特征破坏，且同一药材的化学成分含量受生长周期、贮存条件、炮制方法和生长环境等多方面的影响会有明显变化，因此传统鉴别方法均存在一定局限性。

1.3.2 分子生物学鉴别方法 近年出现的分子生物学鉴定技术不受供试部位、生长发育阶段以及环境条件的影响，直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一无二的准确性和可重复性，实验过程标准化，操作简单快速。王一涵[26]通过选择具有多态性的 ISSR 通用引物扩增三叶青及其近缘种和市场上常见伪品土圞儿后产生的三叶青特异性条带，设计了特异性扩增该片段的特异性三叶青 SCAR 分子探针引物，在12个不同种源的三叶青中均能产生阳性扩增，而与三叶青伪品土圞儿和16个近缘物种的 DNA 均不反应。符渊淼[27]对多段DNA条形码在三叶青及其它崖爬藤属植物鉴别中的应用基础进行了研究，发现rbcL+matK+ITS是鉴定三叶青和其它崖爬藤属植物的最佳条形码，通过对待测样品该DNA条形码区测序后，计算遗传距离聚类鉴别。

本课题组在前期以ITS2序列为基因标记探讨三叶青与其近缘物种亲缘关系及其多种伪混品ITS2区测序的研究基础上，建立了一种快速、可靠鉴别三叶青的PCR-RFLP方法[28]，可直观判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品。与前述方法相比能有效缩短三叶青的鉴定时间；结果为共显性，可以区别出正品三叶青、非三叶青以及掺入了伪品的三叶青；且该方法扩增的ITS2片断仅为400～500 bp，因此受模板质量及PCR扩增条件的影响较小，不易出现假阴性的结果，大大提高了鉴定的准确性。

以上三叶青种质鉴别的分子生物学方法克服了感官或理化分析等方法难以鉴别三叶青真伪的技术问题，保障了三叶青药材用药安全，具有重要的实用价值。

1.4 种质资源类型的评价

1.4.1 不同种质资源类型的农艺性状及经济性状评价 对三叶青药用原植物种质资源的遗传多样性进行评价和群体遗传学的研究，对制定其种质资源保护利用的策略以及指导其遗传育种工作显得尤为重要。蹇京蓉[6]通过标本查阅、野外考察和其它相关数据分析，确定了野生三叶青产地主要包括了13个省区，选取了生长速度、栽培难度、繁殖难度、抗病虫害、抗逆性、多糖含量、总黄酮含量等指标构建评价体系，对不同产区三叶青药用原植物种质资源现状进行了全面评价。结果表明：来自浙江地区的种质资源具有显著的优越性，其次是来自江苏和江西的，而湖北的种质资源综合评价得分最低。然而，一些综合评估中等甚至较低的种质，如：西藏、重庆的种质资源在某些指标，如抗寒性、耐高温性、抗旱性等方面具有极高的优势。该种质资源评价分析结果对于今后的遗传育种工作将具有重要的指导意义。金月山[29]调研了野生三叶青资源的自然分布现状，收集了福建、湖南、广西3地三叶青种质，通过性状特征对比和块根成分检测，认为广西三叶青药用效果相对较低，呼吁规范三叶青药材市场，合理利用三叶青资源。本课题组测定了人工种植和野生三叶青中总黄酮含量，结果显示浙江丽水人工种植三叶青品质优良适于推广种植[30]。郑军献等[31]测定了浙江和广西产地10份三叶青样品中总黄酮的含量，结果显示不同产地药材黄酮含量差异最大可达7倍。许文等[32]采用UPLC-MS/MS 定量分析测定30 批不同产地三叶青中 10 种黄酮类成分结果表明，各类成分含量差异悬殊，甚至有些批次中未检测出。因此，不同产区、不同品种的三叶青有效成分含量及药理活性均差异悬殊，多项研究表明浙江产区三叶青提取物在解热[2]、抑制肝癌细胞增殖[33]的活性等方面都占有明显的优势。

1.4.2 种质资源的遗传多样性评价 袁带秀[34-35]研究发现不同种源地的三叶青酯酶、POD同工酶存在表达差异。本课题组分别对三叶青ISSR[36]、SRAP[37]反应体系和扩增程序进行优化，建立了稳定可靠、多态性好、可用于三叶青遗传多样性分析的遗传分子标记体系，并将其应用于三叶青野生及人工栽培居群27份种质资源的遗传变异水平和结构分析的研究[38]，结果表明三叶青种质遗传变异主要存在于地理居群间，群体间基因流低，野生居群遗传多样性显著高于人工栽培群体，遗传相似性与地理距离有一定的相关性，在此基础上初步分析了三叶青野生资源濒危的原因主要是低水平基因流、地理屏障、无性繁殖及资源过度开发，提出了保护其种质资源的策略。

王一涵[39]采用petL-psbE和trnK-matK基因间隔区对 21 个三叶青群体共 223个个体进行了群体遗传学研究，结果显示三叶青野生群体可划分为西部、中部和东部三个地理居群，其遗传变异主要存在于群体间，基因流极低。Wang[40]采用双抑制PCR法从来自于重庆和福建产区的少量三叶青样品中探索性地发掘了14个SSR位点，为开发三叶青特异性状的遗传标记，实现分子辅助遗传育种奠定了基础。

1.5 种质资源保存

现有的常规植物离体快繁及保存技术需要频繁继代、工作量大、成本高，易导致材料的污染、混淆，且随着继代次数的增加，遗传变异率提高，从而使保存的原始种质基因丢失，出现代谢物含量变化、植株再生能力下降等现象，严重影响试管苗的质量和利用价值。

本课题组建立了一种稳定高效的三叶青种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法[41-42]。通过适宜的培养条件和合理的抑制剂、破眠剂使用，建立三叶青试管苗的限制生长保存以及保存后复苏培养技术体系，使其试管苗保存10个月期间不需继代，植株生长正常，存活率为100%，大大延长继代培养时间，且保存材料的后代经DNA和蛋白质分子标记技术检测均未发生遗传变异。因此该方法可防止常规的传代保存法由于多次传代后造成的种性退化及病毒感染，保证种质的优良性和纯洁性。

2 三叶青种质资源与利用研究展望

三叶青种质资源作为维持其产业可持续发展的源头，深入地开展种质收集、鉴定和评价研究是提升三叶青良种化水平、种质创新与利用的关键，但目前多数研究尚停留在形态学观察、粗成份测定和简单的分子标记聚类上，为充分开发利用和合理保护三叶青种质资源，今后的研究工作可在以下方面深入开展：

2.1 建立完善、系统的三叶青种质鉴定、质量评价体系

三叶青种质资源遗传多样性研究目前已有形态学、细胞学和分子水平，尽管各种研究方法均在一定程度上体现出其遗传资源的丰富程度，然而这些研究的聚类结果之间缺乏有机的统一，甚至个别研究结果间差异较大，这可能是因为各地引种的种质类型本身的差异，或是由于不同生境引起的遗传突变。目前，三叶青种质的品质评价一般根据农艺性状(如：块根产量)和部分成分(如总黄酮)的含量来确定，缺乏对其功能性指标成分或分子指纹等方面的准确鉴定。不同产地不同种质三叶青药材的模式识别及系统评价尚未见报道。因此，构建一个完善、系统的从遗传基础到药效基础，从基因型到表现型，从定性到定量的三叶青基原种质的科学评价体系的工作亟待开展。

2.2 开展特异遗传性状的分子水平深度评价，运用现代分子生物学技术实现分子辅助遗传育种

本课题组目前虽然已有较成熟的三叶青栽培示范苗圃，但在近年来的栽培繁育过程中，也出现了抗病抗寒性差、黄酮含量不稳定、遗传特征逐年退化等现象。因此建立三叶青抗寒性、抗病性评价体系，并对其抗性机制进行分析，筛选抗性种质和抗性基因，开展三叶青功能性成分的评价，筛选优异种质资源，将有利于三叶青种质资源的高效利用。采用常规普通育种技术需观察后代性状分离现象，而其每一代的生长周期即长达数年，因此亟需开展与目标性状关联的分子遗传标记的开发，运用现代分子生物学技术实现分子辅助遗传育种。

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ResearchProgressinUtilizationofTetrastigmahemsleyanumGermplasms

PENGXin1*，JIQingyong2，LIANGYaqing1，ZHANGYujiong1，LOUTianling1

(1.ZhejiangPharmaceuticalCollege，Ningbo315100，China；2.LishuiAcademyofAgriculturalScience，Lishui323000，China)

Tetrastigmahemsleyanumis a precious and rare medicinal herb，which is widely used in clinic.The wild resources ofT.hemsleyanumare on the verge of extinction.The artificial cultivation ofT.hemsleyanumencountered great difficulties，such as a long growth period，andthe poor speciesbreeding.Allof the above lead to thatT.hemsleyanumnow has suffered from mix of variety and degeneration of genetic characterization，which would severely influence the safety and effectiveness for its clinical use.This paper reviewed the research progresses in classifications，breeding，identification，and conservation ofT.hemsleyanumgermplasms.the problems and future research fields of the development ofT.hemsleyanumgermplasms was also put forward.

Tetrastigmahemsleyanum；artificial breeding；germplasm identification；resource assessment

2015-09-20)

浙江省公益技术项目(2013C32103)；浙江省高校访问工程师校企合作项目(FG2014008)；宁波市农业攻关项目(2014C10031)；宁波市科技创新团队(2015C110027);浙江省中医药科技计划项目(2013ZA119)；浙江省新苗人才计划(2013R433007)

*

彭昕，副教授，研究方向：中药生物技术；E-mail：px4142@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.034