人工干预对反复种植失败患者着床窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11表达的影响*

赵　华，王兴玲，李　丽， 李豫峰#

1)华中科技大学附属同济医院生殖中心 武汉 430000　2)郑州大学第三附属医院生殖中心 郑州 450052



人工干预对反复种植失败患者着床窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11表达的影响*

赵华1)，王兴玲2)，李丽2)， 李豫峰1)#

1)华中科技大学附属同济医院生殖中心 武汉 4300002)郑州大学第三附属医院生殖中心 郑州 450052

关键词子宫内膜容受性；子宫内膜搔刮术；同源框基因11；溶血磷脂酸受体3；调经促孕丸；反复种植失败

摘要目的：探讨对反复种植失败(RIF)患者进行人工干预后，着床窗口期子宫内膜组织中溶血磷脂酸受体3(LPAR3)和同源框基因11(HOXA-11)表达变化对临床结局的影响。方法：将92例因输卵管因素不孕的RIF患者分为搔刮组(子宫内膜搔刮,n=31)、中成药组(调经促孕丸，n=31)、未干预组(n=30)。采用RT-PCR和Western blot方法检测3组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11 mRNA和蛋白表达的情况，并观察3组患者临床妊娠率的差异。结果：搔刮组、中成药组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11 mRNA及蛋白表达量高于未干预组，差异有统计学意义(F=57.463和60.771，P<0.001；F=48.816和40.313，P<0.001)，而前两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。搔刮组、中成药组复苏周期临床妊娠率分别是48.4%和32.3%，均高于未干预组(16.7%)，差异有统计学意义(χ2=6.908，P=0.032)，但前两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：子宫内膜搔刮术和口服调经促孕丸2种干预措施均可以改善子宫内膜容受性，提高RIF患者的临床妊娠率。

AbstractAim: To investigate the expressions and significance of LPAR3 and HOXA-11 in the mRNA and protein level at the endometrial implantation phase after the manual intervention in the patients with repeated implantation failure(RIF).Methods: According to the RIF patients′ willingness of receiving manual intervention and the different intervention methods, the 92 RIF patients with fallopian tube-related infertility were allocated into scratching group (n=31), Chinese patent medicine group (n=31) and non-intervention group (n=30).RT-PCR and Western blot were adopted to detect the expressions of LPAR3 and HOXA-11 mRNA and protein at the endometrial implantation phase after the ovulation of the RIF patients. Results: The results of RT-PCR and Western blot showed that the expressions of LPAR3 and HOXA-11 mRNA and protein in the scratching group and Chinese patent medicine group at the implantation window phase noticeably higher than those in the non-intervention group(F=57.463 and 60.771，P<0.001；F=48.816 and 40.313，P<0.001),however, there was no statistical difference between the former two groups. The clinical pregnancy rate(48.4%) in the scratching group and Chinese patent medicine group(32.3%) was higher than that in the non-intervention group(16.7%)(χ2=6.908, P<0.032),however, the comparison of the former 2 groups revealed no statistical difference (P>0.05).Conclusion: Two intervention measures, including the endometrial scratching and taking progestational pills, could improve the endometrial receptivity and enhance the clinical pregnancy rate of the RIF patients.

近年来，随着辅助生殖技术水平的迅猛发展，胚胎的数量及质量都得以优化，但胚胎的植入率却未得到明显的提高。目前多数学者[1-2]把胚胎移植次数≥3次，或者优质胚胎移植数≥10个仍然未能达到临床妊娠，视为胚胎反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)。此类患者排除其胚胎质量问题外，没有其他明确的不孕因素，因此子宫内膜接受胚胎着床的能力下降可能是RIF的原因。如何预测并改善RIF患者子宫内膜容受性，从而提高再次助孕时的临床妊娠率，已成为辅助生殖技术领域研究的热点与难点。该课题组选择2个已经公认的影响子宫内膜容受性的因子——溶血磷脂酸受体3(lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3)和同源框基因-11(hemeobox genes-11，HOXA-11)作为观察指标，对RIF患者进行不同的临床干预后，采用RT-PCR及Western blot方法检测不同干预措施处理后2个因子在子宫内膜表达的差异及临床妊娠结局，分析不同干预措施对临床结局影响的可能机制，从而指导临床选择有效的干预方法，提高辅助生殖技术的临床妊娠率。

1对象与方法

1.1研究对象选择2013年9月至2014年1月在华中科技大学附属同济医院生殖中心因输卵管因素不孕行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)助孕治疗的患者92例，患者均采用标准长方案促排卵后有≥8枚优质胚胎[根据卵裂球对称性和碎片的多少将卵裂期胚胎分为1级胚胎(胚胎卵裂球大小均匀，胞质碎片≤5%)和2级胚胎(胚胎卵裂球均匀或稍不均匀，5%<胞质碎片≤20%)，1级和2级胚胎均视为可移植的优质胚胎]，分别经过3次胚胎移植(<35岁移植2枚胚胎，≥35岁移植3枚胚胎)一直未孕，且至少还有2枚D3冷冻优质胚胎(冻胚)。患者还满足如下纳入标准：年龄<40岁；行优质胚胎移植≥3次，或移植多次优质胚胎累计≥10枚；近两个月内无宫腔操作史，B超检测子宫内膜无异常回声；非子宫内膜异位症患者；输卵管无积水；夫妻双方染色体正常，无活动期传染病；3个月内无口服激素类药物史。按行IVF-ET助孕干预措施的不同把RIF患者分为搔刮组(n=31)、中成药组(n=31)和未干预组(n=30)。2种干预措施及黄体期内膜的获取均在冻胚复苏移植周期的前1或2个月经周期进行。该研究经医院伦理委员会讨论通过，充分尊重患者的医疗知情权和自主选择权，在对患者行子宫内膜取材时，患者知情同意，并签署知情同意书。

1.2干预措施①子宫内膜搔刮术：在冻胚移植前1个月经周期月经来潮6 h内对患者进行子宫内膜搔刮，用小号刮匙送到宫腔底部，轻柔、表浅并且均匀地搔刮子宫腔四壁内膜。②口服中成药(调经促孕丸，审批号：211020027)：患者于月经周期第5天起口服调经促孕丸，早晚各1次，1丸/次(5 g/丸)，连服20 d(1个疗程)，共用2个疗程。

1.3子宫内膜的获取纳入该研究的所有患者均于冻胚移植前1个月经周期第10天监测排卵，排卵异常的患者采用促排卵的方法，两者均于排卵后第5~7天，通过抽拉一次性子宫内膜取样器Pipelle (江苏“苏云”医疗器械公司)的管芯吸取内膜组织，把吸出的少量内膜组织分成2份，分别放入一次性无菌试管中，封口并做标记,于-80 ℃液氮罐中保存。

1.4血清激素的测定月经周期的第2~4天及取子宫内膜的当天早晨，抽取患者空腹外周静脉血3 mL，采用化学发光法检测者血清激素水平。

1.5冻胚移植选择细胞数≥6的1级和2级胚胎D3天冻胚进行复苏移植。无论患者排卵是否正常、月经是否规律均采用人工周期建内膜进行冻胚解冻复苏后移植。自月经周期第3天开始，口服戊酸雌二醇2～4 mg/d，每7 d 1次采用B超监测内膜厚度的变化；根据内膜厚度，戊酸雌二醇用量可增至6～8 mg/d；当内膜厚度≥8 mm时，肌内注射黄体酮60 mg/d(20 mg/支，浙江仙琚制药公司)进行内膜转化，注射黄体酮后第3天行胚胎移植。移植日开始口服达芙通(荷兰苏威制药公司)20 mg/d进行黄体支持。胚胎移植后14～16 d抽取患者静脉血检测β-HCG水平，确定是否妊娠，于移植后第30～35天行阴道超声检查，确定是否临床妊娠及着床孕囊数。

1.63组患者子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11 mRNA表达的RT-PCR检测用Trizol液提取子宮内膜组织中的总RNA，反转录成cDNA。以β-actin为内参，取2 μL模板 cDNA 进行 PCR 扩增。引物序列及大小见表1。PCR反应体系：反转录产物2 μL，上、下游引物各2 μL，Easy Taq Buffer 5 μL，Easy Tap DNA 聚合酶 0.5 μL，dNTPs 4 μL，最后加超纯水至反应体系总体积50 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸2 min。

表1　引物序列及大小

1.73组患者子宫内膜组织中LPAR3和HOXA-11 蛋白表达的Western blot检测将解冻的20 mg内膜组织加入100~200 μL的裂解液直至充分裂解，14 000g离心5 min取上清。制胶跑电泳。将转膜的硝酸纤维素膜放入封闭液中，37 ℃恒温床上低速摇动封闭2 h。把一抗按11 000稀释，4 ℃孵育过夜，按14 000稀释二抗后覆膜37 ℃孵育45 min。最后将硝酸纤维素膜放入化学发光试剂中反应2 min，室温晾干用于拍照，用Bandscan 5.0软件进行灰度值分析。

1.8其他观察指标比较3组患者的年龄、体重指数(body mass index，BMI)、不孕年限、新鲜周期基础状态(月经周期2~4 d)血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、促性腺激素(gonadotropin，Gn)天数、获卵数、复苏周期着床期(排卵后5~7 d)血清雌二醇(E2)、黄体酮(P)水平、胚胎移植数、移植日内膜厚度、妊娠率的差异。临床妊娠：B超可探及宫内孕囊、胎芽及心管搏动；临床妊娠率：临床妊娠周期数/移植周期数×100%。

1.9统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组患者新鲜周期基础情况、复苏周期基础情况、窗口期子宫内膜组织中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2结果

2.13组患者新鲜周期基础情况的比较见表2。

表2　3组患者新鲜周期基础情况的比较

2.23组患者复苏周期基础情况的比较见表3。

表3　3组患者复苏周期基础情况的比较

2.33组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表达的比较见表4、图1和2。

表4　3组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表达的比较

*：与搔刮组比较，P<0.05；#：与中成药组比较，P<0.05。

图1　3组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3、HOXA-11 mRNA表达的比较

图2　3组患者窗口期子宫内膜组织中LPAR3、HOXA-11蛋白表达的比较

3讨论

3.1LPAR3和HOXA-11在子宫内膜胚胎着床过程中的作用LPAR3是一种脂类小分子，在雌性啮齿类动物生殖系统中具有多种功能，参与受精卵在子宫内的移行及胚胎植入子宫内膜的过程[1]；近年来研究[2]发现LPAR3基因敲除小鼠子宫内膜LPAR3 mRNA及其蛋白的表达与受精卵着床时间一致，并与子宫内膜着床期标志物胞饮突共同表达且同步消失，因此LPAR3可以作为小鼠内膜容受性的标志物。

HOXA-11是一类多基因家族的转录调节因子，Rackow等[3]发现不孕症患者HOXA-11基因表达发生改变，从而导致胚胎着床率下降。还有学者[4-5]研究发现HOXA-11基因缺失的小鼠子宫体积缩小、内膜变薄、腺体减少、内膜血管直径变小从而血流量减少，这表明HOXA-11基因的缺失或表达量的下降会导致子宫内膜发育障碍，从而导致胚泡着床率下降。

3.2子宫内膜搔刮术对子宫内膜容受性的影响子宫内膜搔刮术是一种机械局部刺激手段，临床研究[6]发现在月经的早期轻刮子宫内膜各壁，可以改善RIF患者子宫内膜容受性，提高胚胎的植入率、临床妊娠率和活产率，但其作用机制还不完全清楚，可能与促使子宫内膜发生蜕膜样改变，有益于子宫内膜和胚胎种植之间的同步性，诱导着床窗口期的子宫内膜分泌多种有益于胚胎着床的细胞因子有关，其因子包括常见的白血病抑制因子、白细胞介素11等[7]，同时内膜搔刮可以去除内膜局灶性病变，如息肉、增生等病理改变。Raziel等[8]纳入120例行卵胞浆内单精子显微注射技术助孕的RIF患者进行子宫内膜搔刮术，其临床妊娠率有明显的提高。作者的研究显示，内膜搔刮组LPAR3、HOXA-11 mRNA及其蛋白在着床窗口期子宫内膜的表达量明显高于未干预组。RIF患者经过搔刮内膜干预后，其临床妊娠率与未干预组患者比较明显提高；两干预组相比较，内膜搔刮组临床妊娠率也高于中成药组。作者的实验结果显示，内膜搔刮有益于提高RIF患者的临床妊娠率；对行子宫内膜搔刮术的患者术后给予抗生素、止血剂，并在搔刮后第3天叮嘱患者行超声复查，因此内膜搔刮不会引起子宫内膜进一步的损伤，反而会增加内膜对胚胎的接受能力。

3.3中成药对子宫内膜容受性的影响中医学认为肾精、气血和冲任直接参与胚胎着床的过程。张敏等[9]认为根据患者的不同情况合理对症地应用中药，不仅可以促进不孕患者排卵，同时改善子宫内膜容受性，提高妊娠率。中药方主要以补肾益气、调理气血等特性治疗不孕症，收到了良好的临床效果。该研究选取调经促孕丸对RIF患者进行干预性治疗，该中成药由续断、鹿茸(去毛)等18味中草药组成，诸药配合，共奏补肾健脾、养血调经之功，改善患者子宫内膜下血流及内膜微环境，从而达到提高子宫内膜容受性的目的。该研究结果显示，中成药组LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白在着床窗口期子宫内膜的表达量明显高于未干预组，低于内膜搔刮组。中成药组临床妊娠率明显高于未干预组，低于搔刮组；结果表明调经促孕丸可以改善RIF患者的临床结局。黄青兰[10]应用调经促孕丸治疗278例不孕患者取得满意的疗效，作者的研究结果与之相符。

总之，内膜搔刮术在RIF患者的临床治疗中具有较好疗效，而口服中成药调经促孕丸是一种安全、有效、副作用小、能改善内膜微环境的干预措施。但该研究样本量较小，尚需扩大临床样本量，进一步明确内膜搔刮术、口服中成药提高内膜容受性的作用机制，从而为其大规模的临床应用提供理论依据。

参考文献

[1]Ye X,Herr DR,Diao H,et al.Unique uterine localization and regulation may differentiate LPA3 from other lysophospholipid receptors for its role in embryo implantation[J].Fertil Steril,2011,95(6):2107

[2]Sordelli MS,Beltrame JS,Cella M,et al.Interaction between lysophosphatidic acid, prostaglandins and the endocannabinoid system during the window of implantation in the rat uterus[J].PLoS One,2012,7(9):e46059

[3]Rackow BW,Jorgensen E,Taylor HS.Endometrial polyps affect uterine receptivity[J].Fertil Steril,2011,95(8):2690

[4]Alizadeh Z,Faramarzi S,Saidijam M,et al.Effect of intramural myomectomy on endometrial HOXA10 and HOXA-11 mRNA expression at the time of implantation window[J].Iran J Reprod Med, 2013,11(12):983

[5]Varlakhanova N,Cotterman R,Bradnam K,et al.Myc and Miz-1 have coordinate genomic functions including targeting Hox genes in human embryonic stem cells[J].Epigenetics Chromatin,2011,4(4):20

[6]Wise J.Endometrial scratching improves IVF pregnancy rate[J].BMJ,2013,347(1):f6007

[7]Kalma Y,Granot I,Gnainsky Y,et al.Endometrial biopsy-induced gene modulation: first evidence for the expression of bladder-transmembranal uroplakin Ib in human endometrium[J].Fertil Steril,2009,91(4):1042

[8]Raziel A,Schachter M,Strassburger D,et al.Favorable influence of local injury to the endometrium in intracytoplasmic sperm injection patients with high-order implantation failure[J].Fertil Steril,2007,87(1):198

[9]张敏,齐聪,张勤华.温肾活血汤联合克罗米芬改善促排卵子宫内膜容受性疗效研究[J].生殖与避孕,2010,30(9):601

[10]黄青兰.调经促孕丸治疗不孕症278例疗效观察[J].中国医药指南,2011,9(16):325

*国家自然科学基金资助项目81273712

Influence of manual intervention on LPAR3 and HOXA-11 expressions at the endometrial implantation period in RIF patients

ZHAOHua1)，WANGXingling2)，LILi2)，LIYufeng1)

1)TheReproductionCenter,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan4300002)TheReproductionCenter,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsuterine endometrial receptivity;uterine endometrial scratching;HOXA-11;LPAR3;progestational pill;repeated implantation failure

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.022

中图分类号R711

通信作者#，男，1964年6月生，博士，主任医师，研究方向：生殖医学， E-mail:Yufengli64@tjh.tjmu.edu.cn