FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响

李瑾昱，朱艳云，张国庆，孙胜杰，焦顺昌

中国人民解放军总医院肿瘤内一科，北京 100853



FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响

李瑾昱，朱艳云，张国庆，孙胜杰，焦顺昌

中国人民解放军总医院肿瘤内一科，北京 100853

摘要：目的探讨FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用杀伤A549细胞的影响。方法选取肺腺癌A549细胞作为靶细胞，NKTm细胞为效应细胞。基因测序法检测NKTm细胞FCGR3A基因多态性，CCK- 8法检测西妥昔单抗介导NKTm细胞的ADCC活性。结果NKTm细胞FCGR3A具有基因多态性，分别为V/V、V/F及F/F表型。西妥昔单抗介导3种表型的NKTm细胞的ADCC活性差异具有统计学意义(P=0.0015)，其中FCGR3A- 158V/V表型的NKTm细胞的ADCC活性比V/F及F/F表型强(P<0.01)，而V/F与F/F表型的NKTm细胞ADCC活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论西妥昔单抗介导的NKTm细胞ADCC活性与FCGR3A基因多态性有关。

关键词：西妥昔单抗；A549细胞；FCGR3A；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用

ActaAcadMedSin，2015,37(6)：645-649

西妥昔单抗是一种人源化IgG1抗体类药物，通过与肿瘤细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)结合，阻断自身配体介导的EGFR信号传导通路活化，达到抑制肿瘤的作用。作为单克隆抗体类药物，西妥昔单抗的Fc段可被免疫细胞表面Fcγ受体(Fc gamma receptor，FCGR)分子识别，因此，西妥昔单抗一端结合肿瘤细胞，另一端可通过Fc段与免疫细胞的FCGR结合，介导免疫细胞发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，释放细胞毒性因子杀伤肿瘤细胞[1]。ADCC作用被证实是单克隆抗体类药物治疗肿瘤的重要机制之一[2]。而免疫细胞表面Fcγ受体的基因多态性影响其与靶点的结合能力[3]从而影响ADCC作用。有研究认为，FCGR3A基因多态性与西妥昔单抗介导的ADCC作用及临床疗效相关[4- 6]。但上述报道是对结肠癌的研究，而在非小细胞肺癌方面是否FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导的ADCC作用有影响相关报道较少，且目前在非小细胞肺癌的治疗中，西妥昔单抗缺乏有效的疗效预测指标，是否FCGR3A能够作为非小细胞肺癌患者应用西妥昔单抗潜在的预测指标，需要临床前研究。因此，本研究以在临床上用于过继性细胞免疫治疗的NKTm细胞作为效应细胞[7]，探讨在对非小细胞肺癌的体外实验中，FCGR3A基因多态性是否能够影响西妥昔单抗介导的ADCC作用。

材料和方法

材料人肺腺癌A549细胞为我室常规冻存；NKTm细胞由本院肿瘤中心实验室林星石教授培养并提供。RPMI- 1640培养液(GIBCO公司，美国)；胎牛血清(GIBCO公司，美国)；PBS溶液(GIBCO公司，美国)；西妥昔单抗(默克公司，德国)；胰蛋白酶EDTA液(AMRESCO公司，美国)；Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(QIAGEN公司，德国)；细胞计数试剂盒- 8(Dojindo laboratories公司，日本)。HERA Cell 240二氧化碳细胞培养箱(Thermo公司，美国)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo公司，美国)；HERA Safe KS- 12生物安全柜(Thermo公司，美国)；SORVALL LEGEND MACH 1.6R离心机(Thermo公司，美国)；Olympus BX41 正置显微镜(Olympus公司，日本)；Olympus CKX41倒置显微镜(Olympus公司，日本)；Veriti 96well梯度PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)；流式细胞仪(BECKMAN公司，美国)。

靶细胞的制备将A549细胞置于无菌细胞培养瓶中，RPMI- 1640培养液常规传代培养(含100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，10%胎牛血清)，培养条件为37 ℃，5% CO2培养箱。待传代24 h后应用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞后离心洗涤，用RPMI- 1640培养液重悬A549细胞后待用。

NKTm细胞FCGR3A基因多态性的检测Blood & Cell Culture DNA Mini Kit试剂盒提取NKTm细胞DNA，设计引物上游：5’CTCAGGATCTGGGTGGT 3’；下游：5’TGTGATTAGCGTAAGGAAA 3’进行PCR反应。PCR产物送北京三博远志技术有限公司进行电泳、纯化及测序。测序图应用Applied Biosystems公司SeqScanner软件进行分析，以Genebank提供的FCGR3A标准序列为基准，应用NCBI网站Blast程序进行序列比对。

西妥昔单抗介导NKTm细胞ADCC活性的检测取对数生长期的A549细胞，接种于96孔板(5×103个/孔)。37 ℃，5%二氧化碳培养箱孵育12 h；待A549细胞附壁后加入西妥昔单抗。待药物作用18 h后在联合组及NKTm作用组加入NKTm细胞(效靶比为25∶1)。而抗-CD16组则加入经抗-CD16抗体(0.01 mg/ml)封闭30 min后的NKTm细胞。待再培养4 h后所有实验孔加入CCK- 8试剂10 μl。2 h后将培养板置于酶标仪上，测定波长450 nm。记录各孔的光密度(optical density,OD)，以未处理组作为对照组，3个复孔，每组重复3次。

NKTm细胞FCGR3A基因表型对ADCC作用的影响将对数生长期的A549细胞，按5×103个/孔接种于96孔板，37 ℃，5%二氧化碳培养箱孵育12 h后加入西妥昔单抗，继续培养18 h。之后将效应细胞按FCGR3A- 158基因表型不同分为V/V组、V/F组、F/F组，分别加入相应的实验组中(效靶比为25∶1)。培养4 h后所有实验孔加入CCK- 8试剂10 μl。2 h后将培养板置于酶标仪上，测定波长450 nm。记录各孔的OD值，以未处理组作为对照组，3个复孔，每组重复3次。

各组抑制率计算公式(1)西妥昔单抗组=1-(西妥昔单抗组OD值/靶细胞对照组OD值) ×100%。(2)NKTm细胞组=[靶细胞对照组OD值-(NKTm细胞组OD值-NKTm细胞对照组OD值)]/靶细胞对照组OD值×100%。(3)联合作用组=[靶细胞对照组OD值-(联合作用组OD值-NKTm细胞对照组OD值)]/靶细胞对照组OD值×100%。

统计学处理应用SPSS 13.0统计软件，所得数据以均数±标准差表示，采用秩和检验分析方法检验组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

西妥昔单抗介导NKTm细胞ADCC作用与NKTm细胞单独作用组(B组)比较，联合西妥昔单抗显著增强NKTm细胞对A549细胞的杀伤作用(C组)，且差异具有统计学意义(P<0.01)。西妥昔单抗不能增强抗-CD16抗体封闭后的NKTm细胞的杀伤力(D组)，与单独NKTm细胞(B组)比较，差异无统计学意义(图1)。

NKTm细胞FCGR3A基因表型对ADCC作用的影响对NKTm细胞进行FCGR3A-V158F基因多态性的检测，基因测序图见图2。以FCGR3A表型不同的NKTm细胞作为效应细胞，检测西妥昔单抗介导的ADCC作用对A549细胞的杀伤，结果显示西妥昔单抗介导3种表型NKTm细胞的ADCC活性差异具有统计学意义(P=0.0015)，西妥昔单抗介导FCGR3A-V/V表型的NKTm细胞ADCC作用最强，与V/F和F/F表型差异具有统计学意义(P<0.01)，而V/F与F/F表型NKTm细胞ADCC作用对靶细胞的抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。西妥昔单抗或NKTm细胞单独作用对A549细胞的各组抑制率差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

ADCC：抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用;A组：西妥昔单抗组；B组：NKTm细胞组；C组：NKTm细胞+西妥昔单抗组(联合应用组)；D组：NKTm细胞(抗-CD16)+西妥昔单抗组；与A、B、D组比较，aP<0.01

ADCC：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity;Group A：cet- uximab group；Group B：NKTm cells group；Group C：NKTm cells+ cetuxiamb group (the combined application group)；Group D：NKTm cells(anti-CD16)+cetuximab group；aP<0.01 compared with group A，B，and D

图 1ADCC作用对A549细胞的体外杀伤作用

Fig 1ADCC effect against A549 cellsinvitro

箭头：突变位点

arrow：mutation site

A：FCGR3A- 158V/V；B：FCGR3A- 158V/F；C：FCGR3A- 158F/F

图 2FCGR3A基因多态性测序图

Fig 2Single nucleotide polymorphism sequencing diagrams of FCGR3A

与V/F、F/F表型比较，aP<0.01

aP<0.01 compared with genotypes V/F and F/F

图 3FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导NKTm细胞ADCC活性的影响

Fig 3Effect of polymorphic FCGR3A on cetuximab mediated ADCC

讨论

FLEX Ⅲ期临床研究结果表明，西妥昔单抗联合化疗一线治疗晚期非小细胞肺癌可以提高患者的中位生存期(11.3个月比10.1个月)与1年生存率(47%比42%)[8]。然而，与结直肠癌治疗中的研究结果不同的是，西妥昔单抗在非小细胞肺癌的治疗中缺乏有效的疗效预测指标。研究表明K-ras基因突变、EGFR基因突变、EGFR基因扩增、PTEN表达情况均与西妥昔单抗治疗非小细胞肺癌的疗效无关[9- 10]。对FLEX研究的后期数据分析结果显示，EGFR表达水平可能预测西妥昔单抗疗效[11]。而介导免疫反应是单抗类药物重要的抗肿瘤作用机制之一，因此，某些影响免疫的因素有可能成为西妥昔单抗疗效预测指标。

作为人源化IgG1单克隆抗体，西妥昔单抗的ab段与肿瘤细胞表面EGFR结合，其Fc段则可以与淋巴细胞表面Fc受体结合，从而激活淋巴细胞的细胞毒作用，杀伤肿瘤细胞。与西妥昔单抗介导ADCC作用最密切相关的淋巴细胞表面Fc受体为FCGR3A即CD16分子。有文献报道，西妥昔单抗对头颈部鳞状细胞癌的体外杀伤实验中，FCGR3A的基因多态性与西妥昔单抗介导的ADCC活性相关[12]。在结直肠癌的临床试验中同样提示FCGR3A的基因多态性与西妥昔单抗治疗后患者的无进展生存时间相关[4]。然而，在非小细胞肺癌的治疗中，FCGR3A基因多态性与西妥昔单抗介导的ADCC作用是否相关报道较少。

NKTm细胞是将人外周血淋巴细胞进行体外扩增培养、诱导分化而获得的具有高效抗肿瘤活性的混合免疫细胞，以CD3+、CD8+、CD56+和CD16+细胞为主，已作为效应细胞广泛应用于临床过继性细胞免疫治疗[7]。本研究以A549细胞作为靶细胞，NKTm细胞为效应细胞，进行西妥昔单抗介导ADCC作用对非小细胞肺癌细胞的体外杀伤实验，结果表明西妥昔单抗能够特异性地介导NKTm 细胞发挥ADCC作用杀伤A549细胞，联合作用的抑制率显著高于两者单独应用。而NKTm细胞的FCGR(CD16)分子被封闭后西妥昔单抗则不能介导其发挥ADCC作用，表明NKTm细胞主要依靠CD16分子与西妥昔单抗结合从而发挥ADCC作用。本研究分别以FCGR3A基因表型不同的NKTm细胞作为效应细胞，检测西妥昔单抗介导的ADCC活性，结果显示V/V表型的NKTm细胞ADCC活性显著高于V/F型与F/F型(P<0.01)，而V/F型与F/F型NKTm细胞的ADCC活性差异无统计学意义。这与西妥昔单抗在结直肠癌的临床研究结果[4]基本一致。而不同表型的NKTm细胞单独作用对靶细胞的抑制率差异无统计学意义，可见FCGR3A基因表型不同影响的是ADCC作用而非NKTm细胞本身的杀伤作用。有文献报道，FCGR3A-V/V型受体具有与IgG1抗体更强的结合能力[13- 14]；FCGR3A-V/V型的NK细胞CD69和CD107a的表达更高且能够分泌更多的γ-干扰素、白介素- 8、巨噬细胞炎性蛋白- 1α、巨噬细胞炎性蛋白- 1β、趋化因子和肿瘤坏死因子α[12]。这些可能是具有FCGR3A-V/V基因型的淋巴细胞ADCC活性强的原因。

综上，本研究提示免疫细胞表面FCGR3A的基因多态性影响西妥昔单抗介导ADCC作用杀伤非小细胞肺癌，可能西妥昔单抗潜在的疗效预测指标为临床应用及研究提供了基础实验支持。但体内外作用机制存在差异，因此仍需进一步的基础及临床研究加以证实。

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·论著·

Effects of Rapamycin and Rapamycin-loaded Poly(lactic-co-glycolic)Acid Nanoparticles on Apoptosis and Expression of bcl- 2 and p27kip1Proteins of Human Umbilical Arterial Vascular Smooth Muscle Cell

Effect of FCGR3A Polymorphisms on Antibody-dependent Cetuximab-mediated Cytotoxicity in A549 Cells LI Jin-yu，ZHU Yan-yun，ZHANG Guo-qing，SUN Sheng-jie，JIAO Shun-chang

Department of Medical Oncology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

Corresponding author：JIAO Shun-changTel：010- 66937875，E-mail：jiaosc@vip.sina.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of FCGR3A polymorphisms on the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity induced by cetuximab against A549 cells. MethodsA549 cell line was used as target cells and NKTm cells as effector cells. FCGR3A polymorphisms were detected by direct sequencing. The ADCC activity mediated by cetuximab was assessed by CCK- 8 assay. ResultsThree genotypes of FCGR3A were detected：V/V，V/F，and F/F. The ADCC activity of NKTm cells with these three different genotypes mediated by cetuximab were significantly different (P=0.0015). NKTm cells with FCGR3A- 158V/V genotypes had significantly higher ADCC activity than FCGR3A-V/F or F/F genotypes (P<0.01)，whereas the ADCC activity between V/F and F/F genotype showed no statistical significance(P>0.05). ConclusionFCGR3A polymorphisms have an impact on ADCC activity mediated by cetuximab in NKTm cells.

Key words：cetuximab；A549 cells；FCGR3A；antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

收稿日期：(2015- 01- 22)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.06.003

中图分类号:R735.5

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)06- 0645- 05

通信作者：焦顺昌电话：010- 66937875，电子邮件：jiaosc@vip.sina.com

基金项目：军队十一五重点课题(06G106)Supported by the Key Project of the “Eleventh Five-year Plan” for Medical Science Development of PLA of China(06G106)