5种中草药对不同分离株禽源大肠杆菌体外抑菌试验

陈 彬，刘 硕，龚 争※

（1.安徽省蚌埠市禹会区马城镇农办，蚌埠 233411；2.安徽科技学院动物科学学院，凤阳 233100）

5种中草药对不同分离株禽源大肠杆菌体外抑菌试验

陈 彬1，刘 硕2，龚 争2※

（1.安徽省蚌埠市禹会区马城镇农办，蚌埠 233411；2.安徽科技学院动物科学学院，凤阳 233100）

为了探讨5种具有清热解毒功效中草药水提液的体外抑菌活性，采用水煎法提取中草药有效成分，以琼脂扩散法分别测定金银花、蒲公英、连翘、板蓝根和甘草的水提物对本地分离的5株禽源大肠杆菌的抑菌活性及最小抑菌浓度(MIC)。结果表明，对本地5株禽源大肠杆菌抑菌圈最大的是连翘、金银花，其抑菌圈直径约在15～20mm，其次为蒲公英，其抑菌圈直径在10～15mm。连翘、蒲公英、金银花最小抑菌浓度在0.031～0.5g/mL，甘草对两种大肠杆菌的最小抑菌浓度都在0.5g/mL。说明除板蓝根外，其余4种中草药对上述细菌具有不同程度的抑菌效果，连翘、金银花的抑菌效果更佳。

中草药；禽大肠杆菌；体外抑菌；最小抑菌浓度

畜禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的常见传染病之一，为控制该病的发生，抗生素被养殖企业普遍应用，甚至出现滥用、超量使用的现象，导致耐药菌株的大量出现，给动物疫病防控带来严重的负面影响。有研究表明，致病性大肠杆菌已对多种抗生素表现耐药性[1]，而且耐药率在不断增加，临床上甚至已经出现了超强耐药、多重交叉耐药性的大肠杆菌，使该病的治疗变得愈加困难[2]。同时，由于抗生素、化学药物在动物产品中的残留，产生较为严重的食品安全问题，这与国内畜牧业供给侧结构向生产安全、绿色、健康畜禽产品的方向调整的发展战略相悖。在动物疫病防控和动物源性食品安全双重要求下，筛选高效、低毒、安全的抗菌药物越来越迫切。中草药作为我国的传统医药，含有复杂抑菌成分，如多糖、生物碱等天然活性成分，不但具有促进动物生长、提高机体免疫力，增强抗病力的功效[3]，还具有抗菌谱广、不易产生耐药性、可以联合应用等优点[4]。本文以金银花、连翘、甘草、蒲公英、板蓝根5种中草药对不同禽源分离株大肠杆菌的体外抑菌试验，旨在筛选具有较好抑菌效果的中草药，为新型抗菌药物研发和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药材和菌种 金银花(Lonicerajaponica)、蒲公英(Herbahouttyniae Cordatae)、连翘(Fructusforsythiae Suspensae)、甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch)、板蓝根(Radix isatidis)等均购自凤阳华佗医药店；供试大肠杆菌H2、大肠杆菌F、鸡源大肠杆菌、大肠杆菌GW、大肠杆菌G10代均为安徽科技学院动物科学学院微生物实验室提供。

1.1.2 仪器与试剂 超净工作台（苏州安泰空气技术公司）、不锈钢立式压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械厂）、水浴锅（永兴昌医疗器械厂）、GNP-9270BS电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械有限公司）、电磁炉（220V-AC，0-1 000W，北京科伟永兴仪器有限公司）、AL204型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、麦氏比浊管（0.5-5McFarland，北京中西远大科技远大科技有限公司）、游标卡尺（规格（0-150）mm×0.02mm，安徽桐城量具厂)、移液枪、打孔器等。试验所需试剂蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉、NaCI、KH2PO4、和NaOH等均为国产分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 药液的煎制 采用传统的煎煮法制备5种中草药的水提液[5]，称取所需量药材，将药材放入搅拌机内打成粉末状，再加入1 000mL蒸馏水浸泡2h，然后放入干净的锅内加热，沸腾后温度降至80℃再煎煮1h，用八层纱布过滤，药渣再加800mL蒸馏水，加热至沸腾，80℃文火保持1h，八层纱布过滤，合并2次的滤液，滤液经80℃恒温水浴浓缩至药量约1g/mL，121℃高压灭菌20min，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 菌种活化及浓度测定 试验前将保存的各试验菌种接种于普通琼脂斜面培养基上使其活化，然后接种于2mL无菌新鲜肉汤中，在37℃恒温培养箱中培养24h，用微量加样枪吸取100μL菌液加入2mL无菌普通营养肉汤中进行扩陪，37℃培养18h，然后经比浊法进行活菌计数，测定后配制成1×106cfu/mL的菌液[6]。

1.2.3 中药水提物体外抑菌试验 对五种中草药的水提液进行琼脂扩散抑菌试验[7]。按规程严格进行无菌操作，用微量加样枪吸取100μL菌液均匀涂布于琼脂培养基表面，再用直径为6mm的打孔器在培养基上等距离打孔，外围5孔，中心1孔，外围5孔的每孔加入对应标号的无菌药液100μL，中心孔加入生理盐水50μL作为对照，置37℃恒温培养箱中培养24h后观察有无抑菌圈，并测量其直径。每种药液对5种试验菌均做3个平行试验，抑菌圈大小取3次结果的平均值。抑菌效果判定参照以下标准：抑菌圈直径≥20mm为极敏，在15-19mm范围内为高敏，在10-14mm为中敏，≤10mm为低敏[8]。

1.2.4 中药水提物最小抑菌浓度的测定 采用试管倍比稀释法测定中草药水提液对5株禽源大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）。在无菌条件下，将五种中药水提液分别倍比稀释成含药量0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001g/mL的药液，然后再分别加入100μL的菌液，并设置相应的对照组，各稀释药液对每种供试菌均做了3次平行测定。置37℃恒温培养箱中培养24h，通过观察试管内的浑浊情况来判定细菌的生长情况。在本次试验中，为了避免一些有颜色或浑浊的中草药水提液对试验结果造成影响，作用24h后我们将各试验管内的培养液再接种到普通营养琼脂平板上，置37℃恒温培养箱中培养24h，通过观察细菌在培养基上的生长情况来判定最小抑菌浓度。培养基上没有细菌生长而且含中药提取液浓度又最低者即为该种药物对该种菌株的最小抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 中草药水提取物的体外抑菌试验

五种中草药水提物体外抑菌试验结果如表1所示。连翘、金银花的水煮液抑菌效果较好，其抑菌圈直径为15~20mm；其次为蒲公英，其抑菌圈直径在10~15mm。

不同分离株大肠杆菌对不同药液呈现不同的敏感性，连翘对大肠杆菌H2最为敏感，抑菌圈直径大于20mm；连翘、金银花对大肠杆菌F、大肠杆菌G10代的敏感性次之，抑菌圈直径大于15mm；对鸡大肠杆菌仅有连翘、金银花有一定的抑菌作用。甘草对大肠杆菌H2和大肠杆菌GW的抑菌圈直径在10mm以下，为低敏；而板蓝根对5种本地分离株大肠杆菌均无抑菌效果。

表1 抑菌圈测定结果(mm)

2.2 中草药水提取物的最小抑菌浓度测定

由筛选出的4种中草药最小抑菌浓度测定结果（表2）可知，筛选出的4种不同中草药提取物对5株禽大肠杆菌呈现出一定的抑菌活性，而且不同菌种对同一药液也呈现不同的敏感性。其中金银花、蒲公英、连翘的抑菌效果显著优于其他中草药，其中连翘、金银花对试验的5株大肠杆菌具有“广谱”抑菌性；连翘对大肠杆菌H2、大肠杆菌F的最小抑菌浓度均达到0.031g/mL，蒲公英、金银花对大肠杆菌F的最小抑菌浓度分别为0.031g/mL、0.063g/mL，连翘、金银花对鸡大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.5g/mL。

表2 最小抑菌浓度测定结果

3 讨论与结论

中草药及其有效成分抗菌作用机制主要是通过作用于细胞壁或细胞膜系统，作用于细菌细胞内的酶系统或功能蛋白及作用于遗传物质或遗传微粒结构而起作用[9]。更重要的是中草药本身所含有的多种复杂有效成分能够调节机体平衡，提高机体自身免疫力，增强机体被动免疫应答能力，调理和改善机体机能等方面是抗生素、化学药物无法企及的。抗生素、化学药物在动物产品中的残留已引发极为严重的食品安全隐患。因此，为养殖业提供安全、高效、不易产生耐药性的抗菌药物在保障养殖业发展和生产健康、安全、绿色动物产品方面必将发挥积极的促进作用。

试验结果表明，所选用的5种具有清热解毒功效的中草药中，连翘、金银花对5株禽源大肠杆菌具有不同程度的抑制作用，蒲公英对其中的4株有抑菌作用，甘草仅对2株有较弱的抑菌效果，板蓝根无抑菌效果。最敏感的为连翘、金银花、蒲公英，其中连翘水煮液对5种本地常见禽源大肠杆菌的综合抑制效果较好，MIC值较低。中草药抗菌效力的测定对于抗菌药物的筛选意义重大，本试验结果为抗禽类大肠杆菌中草药的研发和临床应用提供参考。

考参文献：

[1]马红霞，邓旭明，欧阳红生，等.不同源性大肠杆菌多药耐药基因AcrA、AcrB部分基因的同源性分析[J].中国预防兽医学报，2003 (2):111-113.

[2]孙 喆，刘树铭.20种中草药对多重耐药大肠杆菌的体外抑菌作用[J].吉林畜牧兽医，2009(11)：6-8.

[3]刘玉庆，李 晔，车程川，等.大肠杆菌对中草药敏感性试验及其方法研究[J].中兽医医药杂志，2003(1):3-5.

[4]褚秀玲，苏建青，韦旭斌.中药抗大肠杆菌病研究进展[J].安徽农业科学，2008，36(21):9 093-9 094.

[5]陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京人民卫生出版社，1988: 69.

[6]张 莉，吴 润，刘 磊.22种中草药对畜禽常见肠道病原菌的体外抑菌作用[J].甘肃农业大学学报，2012，47(5)：7-11.

[7]徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法[M].北京人民卫生出版社，1991:1 346-1 347.

[8]杨建江，韩文瑜，杜 锐，等.30种中草药对耐药性猪链球菌的抑菌试验[J].中兽医医药杂志，2004，23(2):14-16.

[9]陈佳佳，廖森泰，孙远明，等.中草药抑菌活性研究进展[J].中药材，2011，34(8):1 313-1 317.

责任编辑：吴艳玲

The Antimicrobial Tests of Five Kinds of Chinese Herbal Medicine on Different Escherichia Colis from Local Poultry in Vitro

CHEN Bin1,LIU Shuo2,GONG Zheng2
(1.Office of Agriculture in Macheng Town,Yuhui Region,Bengbu City,Anhui Province,Bengbu 233411；2.Anhui Science and Technology University College of Animal Science,Fengyang 233100）

To investigate the antibacterial activity of Chinese herbal medicine extracted liquid with the function of heat-clearing and detoxifying from honeysuckle,dandelion,forsythia,Radix isatidis and Radix glycyrrhizae on five Escherichia coli from local poultry in vitro.The effective components of Chinese herbal were extracted by water decoction method.The antimicrobial activity and minimal inhibitory concentration(MIC)of the water extracts were determined by the agar diffusion method.The results showed that the significant effect of antibacterial activities on five Escherichia coli from local poultry was forsythia and honeysuckle,and the diameter of their bacterial inhibition zones was about 15~20mm.Secondly,the diameter of the inhibition zone from dandelion was 10~15mm.The minimum inhibitory concentration of Forsythia,dandelion and honeysuckle was 0.031~0.5g/mL.Moreover,The minimum inhibitory concentration of licorice on two Escherichia coli was 0.5g/mL.Exceptisatis root,the antibacterial activities of four other Chinese herbal medicine had a different inhibitory effects on those bacteria.And the most significant antibacterial effect was forsythia and honeysuckle.

Chinese herbal medicine;Escherichia colis from poultry;antimicrobial tests in vitro;minimal inhibitory concentration

S855.1

A

2016-07-15

安徽科技学院自然科学研究项目（ZRC2014439）；安徽科技学院重点学科建设项目（AKZDXK2015B03）

陈 彬（1968-），男，安徽省怀远县人，助理畜牧师，从事畜禽生产技术推广与应用。

※为本文通讯作者