转紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14大豆研究

毛璐璐，孔佑宾，李喜焕，张彩英

(河北农业大学/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室，河北 保定 071001)



转紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14大豆研究

毛璐璐，孔佑宾，李喜焕*，张彩英*

(河北农业大学/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室，河北 保定 071001)

为获得磷高效利用转基因大豆新材料，构建紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14超表达载体pBI121-GmPAP14与pCAMBIA3301-GmPAP14，通过农杆菌介导子叶节转化技术将2个载体分别转入高产优质大豆品种，并分析了GmPAP14在转基因植株内的表达情况。结果显示，利用PCR和DNA测序分析可检测到转化植株中的目的条带，其中，转入pBI121-GmPAP14载体的保豆3号阳性植株有6 株；转入pCAMBIA3301-GmPAP14载体的中豆32有9株，冀豆12有11株，农大豆2号20株。进一步将上述T0植株自交，目前已获得T1转基因后代；经实时定量PCR检测，部分株系的GmPAP14表达量显著高于野生型对照，说明GmPAP14已整合到大豆基因组，并能够在转录水平正常表达。

大豆； 紫色酸性磷酸酶基因； 载体构建； 遗传转化； 基因表达

酸性磷酸酶是植物应对低磷胁迫的一种重要水解酶类，直接参与磷代谢转运过程，能催化分解土壤或植株体内的单核苷酸、磷脂等有机态磷化合物，释放无机态磷供植物吸收利用[4]。因此，克隆并转化酸性磷酸酶基因成为提高植物耐低磷特性的新途径。Liang等[5]从菜豆中分离酸性磷酸酶基因PvPAP3，当ATP作为唯一磷源时，PvPAP3能够增强植物对ATP的利用。Wang等[6]将拟南芥酸性磷酸酶基因AtPAP15转入大豆，转基因株系在酸性土壤中的单株荚数和单株粒数较野生型显著增加。Hur等[7]将磷特异诱导基因OsPAP2转入拟南芥，发现超表达转基因拟南芥酸性磷酸酶活性显著高于野生型。Kong等[8]从大豆中克隆获得GmPAP4基因，经转化拟南芥发现，在有机态磷处理条件下，转基因拟南芥生物质量较野生型显著提高。

笔者所在实验室前期克隆了大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14(GenBank No.FJ617239)，植酸磷处理后，超表达转GmPAP14拟南芥植株形态及植酸磷利用相关的生理指标均优于野生型，说明GmPAP14具有提高转基因拟南芥耐低磷能力的作用[9-11]。在此基础上，本研究构建GmPAP14超表达载体，通过农杆菌介导子叶节技术转化高产优质大豆品种，并分析GmPAP14在转基因植株内的表达情况，以获得磷高效利用转基因新材料，为进一步培育磷高效利用转基因大豆新品种(系)提供基础材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所用转化受体包括保豆3号、中豆32、冀豆12和农大豆2号，均为生产上推广的高产优质大豆品种，由河北农业大学大豆遗传育种课题组提供。中间载体pGM-T-GmPAP14为本实验室前期获得，由克隆载体pGM-T与GmPAP14的开放阅读框构建而成。植物表达载体pBI121由本实验室提供，pCAMBIA3301由中国农业科学研究院生物技术研究所提供，农杆菌菌株为EHA105。

1.2 试验方法

1.2.1 植物超表达载体pBI121-GmPAP14的构建 利用限制性内切酶XbaⅠ与BamHⅠ，对中间载体pGM-T-GmPAP14和植物超表达载体pBI121进行双酶切处理，将回收的目的片段采用T4-DNA连接酶进行连接；连接产物转入大肠杆菌DH5α后挑取单克隆，经菌液PCR和酶切检测后，将阳性克隆进一步测序鉴定；提取序列正确的阳性克隆质粒，并转化农杆菌菌株EHA105。PCR扩增所用引物为PAP-F1：5′-GGTACCATGGGTGTTGTGGAGGGTCT-

CT-3′；PAP-R1：5′-GTCGACTTAATGTGAAACATGAGCAG-3′。

1.2.2 植物超表达载体pCAMBIA3301-GmPAP14的构建 利用限制性内切酶PmlⅠ、BamHⅠ酶切中间载体pGM-T-GmPAP14和超表达载体pCAMBIA3301，将回收的目的片段用T4-DNA连接酶进行连接；连接产物转入大肠杆菌DH5α后挑取单克隆，经菌液PCR和酶切检测后，将阳性克隆进一步测序鉴定；提取序列正确的阳性克隆质粒，并转化农杆菌菌株EHA105。PCR扩增所用引物为PAP-F2：5′-GGATCCATGGGTGTTGTGGAGGGT-3′；PAP-R2：5′-CACGTGTTAATGTGAAACATGAGC-3′。

1.2.3 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化技术 转化方法参照邵振启[12]农杆菌介导子叶节遗传转化，其中转pBI121-GmPAP14的外植体再生芽卡那霉素(Kan)筛选质量浓度为0.1 g/L，转pCAMBIA3301-GmPAP14的草铵膦(PPT)筛选质量浓度为0.005 g/L。

1.2.4 转化植株及其后代PCR检测 CTAB法提取大豆植株叶片基因组DNA，对GmPAP14进行PCR扩增和电泳检测。转pBI121-GmPAP14载体大豆植株所用引物序列为PAP-F3：5′-CACGACACACTTGTCTACTCCA-3′；PAP-R3：5′-CCAGTAATGCACTTCGCTCG-3′；转pCAMBIA3301-GmPAP14载体大豆植株所用引物序列为PAP-F4：5′-TGGTTGGGCGGTCGTTCA-3′；PAP-R4：5′-AGCAAAGACATCGCTGTCAAG-3′。其中引物PAP-F3与PAP-R3扩增片段长度683 bp，PAP-F4与PAP-R4扩增片段长度559 bp。PCR扩增程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段进行测序分析。

1.2.5 转GmPAP14阳性植株目的基因表达量分析 以冀豆12-GmPAP14 T1阳性植株及其野生型为材料，提取其RNA并反转录cDNA，以actin11作为内参对照，分别设计目的基因GmPAP14与内参基因actin11实时定量PCR引物(PAP-F5：5′-TCAAGCAGCCCCTTCATTAG-3′,PAP-R5：5′-AGTTTTC-CTTCGGCAATCTTC-3′;actin11-F1：5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′,actin11-R1：5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′)，反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40 个循环；利用2-△△Ct方法进行目的基因表达量分析。

2 结果与分析

2.1 植物超表达载体pBI121-GmPAP14的构建

通过酶切和连接获得植物超表达载体pBI121-GmPAP14，将载体转化大肠杆菌DH5α，对获得的单克隆菌液进行PCR扩增，得到大小为1 395 bp的目的片段；利用XbaⅠ、BamH Ⅰ双酶切鉴定阳性克隆，获得GmPAP14片段(图1)；进一步将阳性克隆测序分析，得到了序列正确的超表达载体pBI121-GmPAP14，用于后续大豆品种遗传转化(图2)。

a.菌液PCR检测，M：DNA Marker DL2000； B：空白对照；1—8：pBI121-GmPAP14阳性单克隆。b.酶切鉴定，M：DNA Marker DL2000； 1：未酶切对照；2：酶切后的pBI121-GmPAP14

图2 超表达载体pBI121-GmPAP14示意图

2.2 植物超表达载体pCAMBIA3301-GmPAP14的构建

通过酶切和连接获得植物超表达载体pCAMBIA3301-GmPAP14，将载体转化大肠杆菌DH5α，对获得的单克隆菌液进行PCR扩增，得到大小为

1 395 bp的目的片段；采用BamHⅠ、PmlⅠ双酶切鉴定阳性克隆，获得GmPAP14目的片段(图3)；进一步将阳性克隆测序分析，得到了序列正确的超表达载体pCAMBIA3301-GmPAP14，用于后续大豆品种遗传转化(图4)。

a.菌液PCR检测，M：DNA Marker DL2000；B：空白对照；1—8：pCAMBIA3301-GmPAP14阳性单克隆。

b.酶切鉴定，M：DNA Marker DL2000； 1：未酶切对照；2：酶切后的pCAMBIA3301-GmPAP14

图3 含pCAMBIA3301-GmPAP14载体菌液的PCR与酶切鉴定

图4 超表达载体pCAMBIA3301-GmPAP14示意图

2.3 转GmPAP14大豆阳性植株及其后代PCR检测结果

采用农杆菌介导子叶节转化技术(图5)，将超表达载体pBI121-GmPAP14转入保豆3号，将pCAMBIA3301-GmPAP14载体转入中豆32、冀豆12和农大豆2号。对转化植株进行PCR检测，含不同载体的大豆品种均能扩增出目的条带，片段大小分别为683 bp、559 bp；回收目的条带并进行测序分析，与对应表达载体基因序列完全一致。其中，转pBI121-GmPAP14保豆3号有6株；转pCAMBIA3301- GmPAP14中豆32有9株，冀豆12有11株，农大豆2号有20株。将阳性植株自交，进行目的基因PCR检测和测序分析，获得了转有GmPAP14的T1植株(图6，图7)。由此说明，GmPAP14已整合于大豆品种基因组中，且可自交遗传至T1。

A：种子消毒； B、C：萌发培养； D：共培养； E：芽诱导； F：芽伸长； G、H：生根； I：炼苗； J：移栽

a.PCR检测，M：DNA Marker DL2000； B：空白对照； W：野生型对照； 1—11：转化植株； P：阳性对照。

a.PCR检测，M：DNA Marker DL2000； B：空白对照； W：野生型对照； 1—13：转化植株； P：阳性对照。

2.4 转GmPAP14大豆目的基因表达量分析

采用实时定量PCR技术对获得的转GmPAP14 T1阳性材料冀豆12-GmPAP14进行目的基因表达量分析，结果发现，5个转基因株系中，有3个株系(OE-3、OE-4、OE-5)中的GmPAP14表达量显著高于野生型对照(图8)，说明GmPAP14在上述3个株系中能够正常转录表达。

WT：野生型对照； OE-1—OE-5：转GmPAP14不同大豆株系

3 结论与讨论

紫色酸性磷酸酶是一类具有双核金属脱氢酶特征的含铁糖蛋白，有5个保守基序、7个高度保守氨基酸残基，大多具有非特异性，在植物组织中广泛分布[13]。它是植物对土壤有机磷利用和植株体内磷重新分配过程的重要参与者。在低磷胁迫条件下，酸性磷酸酶在植物体内活性增强，进而分解单核苷酸、磷脂等有机磷，释放出无机磷供植物生长发育所需。与此同时，根系分泌酸性磷酸酶增多，活化土壤有机磷成分供植物吸收利用，进而维持植物体磷素平衡[14-16]。

迄今，有关大豆酸性磷酸酶基因的研究报道较少。笔者所在课题组筛选得到磷高效大豆品种中黄15，并从中克隆得到酸性磷酸酶基因GmPAP14。比对分析GmPAP14编码蛋白质与其他物种紫色酸性磷酸酶的同源性，发现其与豆科植物GmPAP1及MtPAP1有较近的亲缘关系[9-10]，GmPAP1被证实在低磷胁迫下能提高大豆植株磷利用率，转化MtPAP1基因的拟南芥和白三叶草在有机态磷处理下的生物学产量显著高于野生型，且吸收利用有机磷的能力明显提高[17-20]。GmPAP14经植酸磷处理14～70 d，其在磷高效大豆品种的表达量持续显著高于磷低效品种，且证实转GmPAP14拟南芥具有分解根际周围植酸磷的能力[11]。

在此基础上，本研究利用农杆菌介导大豆子叶节转化技术将GmPAP14转入保豆3号、冀豆12、中豆32和农大豆2号等高产优质大豆品种中，经PCR扩增与测序分析，证实GmPAP14已稳定整合至上述品种基因组中，目前已获得T1转基因后代；经进一步采用实时定量PCR技术检测GmPAP14在不同转基因株系中的表达情况，结果发现，GmPAP14在不同株系中的RNA水平表达量存在一定差异，分析其原因可能与不同株系中的GmPAP14整合位置及其拷贝数等因素有关；基于不同转基因株系中的目的基因表达情况，本研究筛选出GmPAP14表达量较野生型显著提高的3个新材料，为今后继续深入研究GmPAP14在来源物种中的生物学功能及其耐低磷转基因新品种(系)培育奠定重要物质基础。

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Transformation of Soybean with Purple Acid Phosphatase GeneGmPAP14

MAO Lulu,KONG Youbin,LI Xihuan*,ZHANG Caiying*

(Agricultural University of Hebei/North China Key Laboratory of Crop Germplasm Resources, Education Ministry of China,Baoding 071001,China)

To obtain new transgenic soybean materials with high phosphorus utilization efficiency,the over-expression vectors pBI121-GmPAP14 and pCAMBIA3301-GmPAP14 were constructed base onGmPAP14,a purple acid phosphatase gene,and were introduced into high-yield soybean varieties byAgrobacterium-mediated cotyledonary-node transformation method.The results of PCR amplification and DNA-sequencing analysis showed that the target bands were detected in transformed plants.Total six PCR positive plants of vector pBI121-GmPAP14 in Baodou 3,and nine,eleven,twenty PCR positive plants of vector pCAMBIA3301-GmPAP14 in Zhongdou 32,Jidou 12,Nongdadou 2 were obtained,respectively.T1transgenic plants were obtained by selfing of T0transformed plants,and the results of real-time quantitative PCR showed that the expression ofGmPAP14 in transgenic plants were significantly higher than that in the wild-type control,which suggested that theGmPAP14 was incorporated into the soybean genome and could express at the transcriptional level.

soybean; purple acid phosphatase gene; vector construction; genetic transformation; gene expression

2016-06-02

转基因生物新品种培育科技重大专项(2014ZX0800404B)；国家自然科学基金项目(31401405)

毛璐璐(1990-)，女，黑龙江鹤岗人，在读硕士研究生，研究方向：大豆分子生物学与转基因研究。 E-mail:maolulu524@163.com

*通讯作者：李喜焕(1974-)，女，河北保定人，副教授，博士，主要从事大豆遗传育种与转基因研究。 E-mail:lixihuan@hebau.edu.cn 张彩英(1960-)，女，河北深泽人，研究员，博士，主要从事大豆遗传育种与转基因研究。 E-mail:zhangcaiying@hebau.edu.cn

S565.1

A

1004-3268(2016)11-0025-05