基于SSR标记的49个大白菜自交系遗传多样性分析

原静云，李小军，任翠翠，原连庄

(1.河南省新乡市农业科学院，河南 新乡 453003； 2.河南科技学院，河南 新乡 453003)



基于SSR标记的49个大白菜自交系遗传多样性分析

原静云1，2，李小军2，任翠翠2，原连庄1*

(1.河南省新乡市农业科学院，河南 新乡 453003； 2.河南科技学院，河南 新乡 453003)

利用扩增条带清晰且覆盖白菜10个连锁群的33个SSR标记分析了49个大白菜自交系的遗传多样性。结果表明，22对引物在供试材料间表现多态，11对引物表现单态扩增，多态引物频率达到66.7%，其中A1、A3、A8和A9连锁群上多态引物比例相对较高。多态引物共扩增出68个等位变异，每个位点2～8个，平均3.09个；不同引物的多态性信息含量0.05～0.88，平均0.48；品种间的遗传距离变异为0～0.93，所有成对遗传距离的平均值为0.51，UPGMA聚类结果与品种间亲缘关系及其农艺特征有较好的一致性。

遗传多样性; 大白菜; SSR

大白菜起源于我国，在我国蔬菜栽培中属于第一大类蔬菜，深受消费者喜欢。它属于异花授粉作物，天然异交率高极易产生新的变种；同时由于我国地域广阔、气候各异，不同地区间又形成了许多各具特色的品种资源；再加上国内外广泛的引种和杂交选育形成了许多新的白菜品种。最终形成了我国白菜资源丰富、遗传背景相对复杂的现状，这也为大白菜种质资源整理、分类及育种工作带来了一定困难。因此，分析评价国内主要白菜种质资源或自交系的亲缘关系是遗传研究的一项重要内容。

SSR(simple sequence repeats)标记分布于植物整个基因组，具有多态性高、共显性遗传和易于分析等特点，已在白菜等作物的遗传研究中逐步应用[1]。秦艳梅等[2]利用SSR标记分析了在我国广泛种植的78份蔬菜用不结球白菜品种的遗传关系，发现这些不结球白菜内部存在着明显的群体结构。杨旭等[3]应用SSR等标记构建了包含326个标记位点的白菜遗传图谱，分别定位了5个和15个控制叶片数和单株质量的QTL。本研究选用白菜10个连锁群上的SSR标记，分析49个大白菜自交系的遗传关系，为大白菜种质资源保存及亲本选配提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料包括49份大白菜材料，均是新乡市农业科学院大白菜育种中利用的重要自交系或不育系(表1)。

表1 供试大白菜自交系

1.2 方法

1.2.1 SSR引物选择及分子标记分析 选取分布于芸薹属A 基因组10 个连锁群上的50对SSR引

物，所有引物序列从文献[4-5]获得，由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

所有材料在培养皿中发芽，待长出2片嫩叶后采用CTAB法提取DNA[6]。PCR反应体积为20 μL，含1×buffer(0.01 mol/L Tris-HCl，pH值8.3，0.05 mol/L KCl)、0.001 5 mol/L MgCl2、0.2 mol/L dNTPs、0.1 μLTaq酶(5 U/μL)、50 ng引物和60 ng模板DNA。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延长10 min。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，硝酸银染色。

首先从49份材料中选择3份材料(晋毛可育、陕5555和C皇)对50对SSR引物进行筛选，选择扩增条带清晰且覆盖白菜10个连锁群的引物。采用33对引物对所有材料进一步检测，每个连锁群上的SSR标记数目1～5个。SSR扩增带型在相同迁移率位置上有带记为1，无带记为0，建立0、1数据库。

2 结果与分析

2.1 大白菜自交系的SSR多态性分析结果

在33对SSR引物中(表2)，22对在49个供试材料间表现多态，11对引物(CB10471、NI2-C12、Na12-E03、MR036、BRAS063、BRAS072、BRAS014、CB10278、OI10-F09、OI12-E03和MR156)表现单态扩增，多态引物频率达到66.7%。多态性引物在白菜10个连锁群的分布也存在一定差异(表3)，其中A1、A3、A8和A9连锁群上所检测的引物均表现多态扩增。图1为引物BRAS078在供试材料中的电泳图谱。

表2 SSR引物及其检测到的等位变异数和PIC

续表2 SSR引物及其检测到的等位变异数和PIC

多态引物共扩增出68个等位变异，每对引物位点2～8个，平均3.09个，其中有7对引物(Na10-C03、BRAS029、Na14-E02、CB10080、CB10143、Ra2-G08和Na10-B11)扩增的等位变异数达到4个及以上。A2连锁群上的CB10471和NI2-C12在所有材料中只扩增出1个等位变异，且这2对引物分别在3份、5份材料中存在等位变异缺失，A3连锁群上的引物Na14-E02扩增的等位变异数最多。A3、A5、A7、A8和A9连锁群上平均每对多态引物扩增的等位变异大于或等于3.00个。22对多态引物间的PIC变异范围为0.05～0.88，平均为0.48。

表3 10个白菜连锁群的SSR多态性

连锁群引物数/对多态引物数/对(占比/%)等位变异数/个每对多态引物的等位变异数/个A144(100)102．50A241(25)22．00A344(100)164．00A421(50)22．00A531(33．3)66．00A654(80)102．50A752(40)63．00A811(100)33．00A933(100)113．67A1021(50)22．00

材料编号同表1

2.2 大白菜自交系的遗传距离分析结果

从品种两两之间的遗传距离来看，遗传距离变异为0～0.93，所有成对遗传距离的平均值为0.51。其中J来不育和J来可育之间与D17和J开之间的遗传距离都为0，J来不育和F78之间的遗传距离最大，达到0.93。

2.3 大白菜自交系的聚类分析结果

UPGMA聚类结果与品种间亲缘关系或其农艺特征有较好的一致性(图2)。以遗传距离系数0.48为基准，将49份材料划分为6个类群。第Ⅰ类群有9个自交系，其中J来不育和J来可育、晋毛不育和晋毛可育、A夏黄和宜黄分别聚在一起，它们在表型上只有育性或花色存在差异，同时这个类群包括了高桩、合抱和叠抱3个类型。第Ⅱ类群有7个自交系，其中安包与Q2黄聚在一起，2个自交系在外形上相对一致，具有晚熟、大球、叠抱特征；其他品种都具有早熟、小球、叶片较厚且无毛特征。第Ⅲ类有8个自交系，除1304是一个早熟、有毛、轻叠抱自交系外，其他主要是合抱类型自交系。第Ⅳ类有6个自交系，多属于无毛类型自交系。第Ⅴ类有12个自交系，J开和D17聚在一起，其外观特征也完全一致，可能是异名同源自交系；杂浅与杂小聚在一起，杂小在外形上是杂浅的缩小版，是从杂浅中选出的突变体；其中除J80、J75、J细脉3个自交系是麻叶类型之外，其他自交系都属于中熟叠抱自交系。第Ⅵ类有7个自交系，主要是高桩类型，只有56-3是早熟叠抱类型。

3 结论与讨论

形态标记是白菜种质资源研究的传统方法，但田间鉴定的表型性状数量偏少，遗传表达易受环境影响。20世纪90年代以来，分子标记技术逐渐成为植物基因组研究的重要手段。与田间种植鉴定相比，DNA分子技术具有高效、准确、受环境条件影响小、试验操作简单和周期短等优点。目前SSR是白菜种质资源研究中应用最为广泛的分子标记之一，非常适合材料间的遗传关系评价。杨华等[8]利用SSR标记和农艺性状分析了上海地区17份甘蓝和44份白菜的遗传差异，发现上海地区的甘蓝类蔬菜遗传多样性比较丰富，而白菜类蔬菜的遗传基础比较单一，现有的白菜型蔬菜种质资源急需保护，以防遗传流失。高玉梅等[9]利用SSR标记分析了64份白菜类品种的遗传结构。秦艳梅等[2]利用筛选出的21对多态性SSR引物在78 份白菜品种中扩增出56个等位变异，平均每个SSR标记产生2.7个等位变异，与本研究中每对多态引物扩增出的等位变异数(3.09个)相近。本研究基于SSR标记聚类结果较好地反映了大多数大白菜自交系的亲缘关系并与主要农艺性状特征有较好的一致性，进一步表明分子标记技术是植物基因组研究的重要手段,但形态性状和分子标记相结合比单独应用其中的一种可能更加有效。聚类分析也发现，个别亲缘关系相近的材料(如J75和J75浅)分布于不同的类群中，说明这些材料间具有广泛的遗传变异性。本研究可以使育种者清楚地了解到这些种质资源的遗传关系，为品种改良过程中对杂交亲本的高效利用提供理论依据；同时还可以了解不育系的转育进程，为大白菜不育系在生产上的大面积推广应用提供科学保障。

图2 供试大白菜基于UPGMA的聚类结果

[1] 李丽,郑晓鹰.用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立[J].园艺学报,2009,36 (11):1627-1634.

[2] 秦艳梅,李向,赵建军,等.不结球白菜品种基于SSR标记的群体结构分析[J].华北农学报,2013,28(3):62-66.

[3] 杨旭,余阳俊,张凤兰,等.应用DH群体进行白菜叶片数和单株重的QTL定位与分析[J].分子植物育种,2008,6(6):1213-1218.

[4] Piquemal J,Cinquin E,Couton F,etal.Construction of an oilseed rape(BrassicanapusL.) genetic map with SSR markers[J]. Theor Appl Genet,2005,111:1514-1523.

[5] Lowe A J,Moule C,Trick M,etal.Efficient large-scale development of microsatellites for marker and mapping applications inBrassicacrop species[J].Theor Appl Genet,2004,108:1103-1112.

[6] Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research,1980,8:4321-4325.

[7] Powell W,Morgante M,Andre C,etal.The comparison of RFLP,RAPD,AFLP and SSR(microsatellite) markers for germplasm analysis[J].Mol Breed,1996,2:225-238.

[8] 杨华,刘灶长,陈海荣,等.上海地区芸薹属蔬菜遗传多样性研究[J].植物遗传资源学报,2006,7(3):264-269.

[9] 高玉梅,张淑江,章时蕃,等.白菜类作物资源群体结构分析[J].中国农学通报,2009,25(21):332-334.

Genetic Diversity Analysis of Forty-nine Chinese Cabbage Varieties Using SSR Markers

YUAN Jingyun1,2,LI Xiaojun2,REN Cuicui2,YUAN Lianzhuang1*

(1.Xinxiang Academy of Agricultural Sciences in Henan Province,Xinxiang 453003,China; 2.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Genetic diversity of forty-nine Chinese cabbage varieties was evaluated using 33 SSR markers distributed across the whole genome.Twenty-two(66.7%) of 33 SSR markers were polymorphic across all the genotypes,and the remaining amplified identical fragments in size,respectively.The frequencies of polymorphic markers on linkage groups A1,A3,A8 and A9 were higher than others.The polymorphic markers amplified 68 alleles with a mean of 3.09 alleles per locus,which varied from 2 to 8 among polymorphic locus.The values of polymorphism information content varied from 0.05 to 0.88 with an average of 0.48.The genetic distances between genotypes ranged from 0 to 0.93 with a mean of 0.51.Cluster analysis by UPGMA accorded with the genetic relationship and agronomic characteristics of these Cabbage varieties.

genetic diversity; Chinese cabbage; SSR

2016-06-20

河南省大宗蔬菜产业技术体系建设专项资金项目(S2010-03-06)；新乡市科技创新人才项目(RC15001)

原静云(1985-)，男，河南沁阳人，实习研究员，硕士，主要从事大白菜新品种选育及推广工作。 E-mail:yuanjy886@163.com

*通讯作者：原连庄(1961-)，女，河南沁阳人，研究员，本科，主要从事大白菜新品种选育及栽培研究工作。 E-mail:yuanlianzhuang@163.com

S634

A

1004-3268(2016)11-0092-04