鸡4种主要RNA病毒病多重感染复合PCR检测方法的建立

刘 媛，李学伍，王 丽，谷 雨，王林建

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 生物工程学院，河南 郑州 450002)



鸡4种主要RNA病毒病多重感染复合PCR检测方法的建立

刘 媛1，李学伍2，王 丽2，谷 雨3，王林建3

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023； 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 生物工程学院，河南 郑州 450002)

依据GenBank中注册的禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组核苷酸序列，通过序列比对获得AIV、IBV、NDV、IBDV的相对保守序列。根据每种病毒的保守序列利用生物学软件分别设计3对特异性引物，4种病毒共设计12对引物，并对12对引物进行模拟筛选，获得匹配最佳的4对引物。对获得的最佳匹配引物进行单项PCR验证，优化复合PCR反应条件，确定最佳的退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶使用量；经特异性、敏感性及简化PCR试验，最终建立了简易复合PCR检测方法。结果表明，建立的检测方法可同时扩增出4条大小与设计相符的特异性片段，即IBV(146 bp)、NDV(215 bp)、IBDV(345 bp)、AIV(435 bp)；建立的复合PCR方法具有较强的敏感性和特异性，能检测出100 pg AIV、IBV、IBDV的cDNA和100 fg NDV的cDNA；将三温热循环改进为二温热循环，即将退火和延伸过程合为一步(62 ℃)，大大缩短了反应时间。

禽流感病毒； 鸡传染性支气管炎病毒； 新城疫病毒； 传染性法氏囊病毒； RNA病毒； 复合PCR

禽流感(avian influenza，AI)、鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)、新城疫(Newcastle di-sease，ND)和传染性法氏囊病(infectious bursal di-sease，IBD)是鸡常见的重要RNA病毒病。其中，禽流感病毒(AIV)为正黏病毒科甲型流感病毒属，鸡传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒科冠状病毒属的代表种，新城疫病毒(NDV)属副黏病毒科腮腺炎病毒属，传染性法氏囊病病毒(IBDV)属双RNA病毒科、禽双RNA病毒属，这4种病毒均为RNA病毒[1-4]。AI、IB、ND和IBD具有流行广泛、传染性强、发病率和死亡率高、治愈率低、危害大等特点；且临床上常发生混合感染或继发感染，给养鸡业造成了巨大的经济损失，严重影响养鸡业的发展。这些疫病的发病特征、临床症状和剖检变化相似不易区分，传统的病原分离鉴定和血清学方法无法进行快速检测和鉴别诊断，严重影响对这些疫病的有效防制。因此，建立一种特异、敏感、快速的检测方法，对于鸡主要病毒性传染病的诊断和防控十分迫切和必要。

近年来，利用普通PCR、实时荧光定量PCR、核酸探针、环介导等温扩增、固相基因芯片、液相芯片等技术检测病毒已有很多报道，其中PCR技术已被广泛应用于多种疫病的检测诊断[5]，但都是对单一病毒进行检测，无法对多种病原混合感染进行快速鉴别诊断。复合PCR技术不仅具有普通PCR特异性强、敏感性高、快捷简便的优点，而且可在一个反应体系中同时扩增多份DNA或RNA样本的不同目的基因片段，由此可以检测鉴别多种不同的病原体，特别适用于快速诊断多种混合感染的临床样本[6-8]。建立快速、准确、一次性检测4种病毒的检测方法，对预防和控制上述疫病具有重要意义，鉴于此，本研究建立针对上述4种RNA病毒的简易复合PCR检测方法，以达到在同一反应体系中同时扩增出对应病原体特异核酸片段的目的，为鸡主要RNA病毒病病原的快速准确检测奠定基础。

1 材料和方法

1.1 毒株

IBV(LDT3-A株)、NDV(LaSota株)、IBDV(B87株)为哈尔滨兽医研究所维科生物有限公司生产的活疫苗，AIV尿囊液(H9N2株)由河南省动物免疫学重点实验室提供。

1.2 主要试剂

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；反转录试剂盒、DEPC处理水、PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 引物的设计与合成

从GenBank中下载AIV、IBV、NDV、IBDV基因组核苷酸序列，即AIV的HA基因(GI：6537263，序列长度为1 064 bp)、IBV的N基因(GI：806017795，序列长度为1 230 bp)、NDV的L基因(GI：41323390，序列长度为6 615 bp)、IBDV的B基因(GI：114864536，序列长度为2 827 bp)，通过序列比对获得AIV、IBV、NDV、IBDV 4种病毒基因的相对保守序列[9-10]；按照复合PCR对引物序列和退火温度等因素的要求，根据病毒的保守序列应用Primer Premier 6.0生物学软件设计3对特异性引物，4种病毒共设计12对引物，利用生物学软件模拟筛选出匹配最佳的引物，即能同时扩增上述4种病原特定核酸片段的特异性引物[11]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取

将IBV、NDV、IBDV冻干疫苗用DEPC处理水制成悬液，根据UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书对AIV、IBV、NDV、IBDV总RNA进行提取；随即对总RNA进行反转录，cDNA于-20 ℃或-70 ℃保存备用[12]；测定4种cDNA的浓度及OD260/OD280值，并稀释cDNA至工作浓度。

1.5 单项PCR扩增

分别将提取的IBV、NDV、IBDV、AIV的cDNA与对应的匹配最佳的引物混合，建立50 μL常规PCR反应体系：PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye) 25 μL，病毒特异性上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，高压双蒸水补足至50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，在不同退火温度下退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束反应。用2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。

1.6 复合PCR反应条件优化

在单项PCR扩增反应体系和反应程序的基础上，将RNA病毒AIV、NDV、IBV和IBDV的cDNA(各1 μL)以及各种反应试剂混合在一起进行复合PCR反应条件的优化，以确定最佳的PCR反应条件。条件的优化主要包括退火温度的优化、引物浓度的选择、TaqDNA聚合酶使用量的优化[13]。经复合PCR扩增筛选出最佳的反应条件。

1.7 复合PCR敏感性试验

将提取的AIV、NDV、IBV和IBDV的cDNA进行核酸定量，测定各病原核酸的浓度，用DEPC水10倍梯度倍比稀释，模板稀释倍数依次为101、102、103、104、105、106、107。取各稀释度的cDNA为模板，采用最佳复合PCR反应优化条件进行扩增，通过最低检出量来确定其敏感性。

1.8 复合PCR特异性试验

将AIV、IBV、NDV、IBDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽痘病毒(FPV)、 马立克氏病毒(MDV)7种

病毒的cDNA依次加入和同时一起加入到优化好条件的复合PCR反应体系中进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，检测其是否具有特异性[14]。

1.9 复合PCR简化试验

在经典PCR技术原理的基础上，依据酶学原理对常规PCR三温循环进行改进。将上述4种病毒的退火及延伸的温度设置在同一温度，确保在酶活性不是最高的条件下，与模板退火结合的引物也可以短时间内充分延伸形成产物片段，减少升降温过程，从而缩短反应时间，提高反应速度[15-16]。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

利用生物学软件对12对引物进行模拟筛选，获得并合成匹配最佳的4对引物，引物序列见表1。

表1 IBV、NDV、IBDV、AIV复合PCR扩增匹配引物

2.2 单项PCR扩增结果

由图1可见，各病毒均扩增出与试验设计相符的特异性条带，分别是：IBV 146 bp、NDV 215 bp、IBDV 345 bp、AIV 435 bp。可见，设计引物在单项PCR扩增试验中均可获得特异扩增片段，实现了单独检出其对应病毒的目的，且效果良好。

M：DNA Marker； 1—4：分别为AIV、IBV、IBDV、NDV

2.3 复合PCR反应条件的优化结果

在单项PCR扩增反应体系和反应程序的基础上，通过对复合PCR反应条件中退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化，确定复合PCR的最佳反应条件。

2.3.1 退火温度 在单项PCR基础上，利用4对引物在同一反应体系中同时扩增4种病毒的混合模板，建立复合PCR方法。根据设计引物的Tm值，确定复合PCR体系的退火温度范围，设置温度梯度进行体系退火温度的优化，试验温度分别为55、56、58、60、62 ℃。结果显示，退火温度在55、56 ℃时均呈现良好扩增结果(图2)。为确保PCR反应的特异性，选择56 ℃为最佳退火温度。

M：DNA Marker； 1—5：退火温度分别为55、56、58、60、62 ℃

2.3.2 引物浓度 选择不同的引物浓度进行复合PCR扩增，同时提高IBDV的引物浓度；则复合PCR反应体系为：PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)25 μL，cDNA各1 μL，上、下游引物各1 μL，灭菌双蒸水补足至50 μL； AIV、IBV、NDV上下游引物浓度分别均设为25、50、100、150、200 μmol/L，IBDV上下游引物浓度分别为50、75、125、175、225 μmol/L。结果显示，AIV、IBV、NDV引物浓度在100 μmol/L，IBDV引物浓度在125 μmol/L时的条带最亮(图3)。因此，选用AIV、IBV、NDV引物浓度100 μmol/L，IBDV引物浓度125 μmol/L为最佳引物浓度。

M：DNA Marker； 1—5：IBV、NDV、AIV引物浓度

2.3.3TaqDNA聚合酶使用量 以优化完成的退火温度、引物浓度为基础,在建立的复合PCR 50 μL反应体系中，将PremixTaq(0.05 U/μL)使用量分别设定为15、20、25、30、35 μL进行PCR扩增。结果显示，PremixTaq使用量为25 μL时效果最佳(图4)。

M：DNA Marker； 1—5：Premix Taq(0.05 U/μL)

2.4 复合PCR的敏感性检测

将10倍递进稀释后的AIV、IBV、NDV、IBDV的cDNA作为模板，模板质量浓度分别为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 pg/μL。采用最佳的退火温度、引物浓度和PremixTaq使用量等复合PCR反应条件，进行复合PCR扩增以检测其敏感性。敏感性试验结果显示：该复合PCR至少能同时扩增到100 pg AIV、IBV、IBDV和100 fg NDV的cDNA(图5)。

M：DNA Marker； 1—7：模板质量浓度分别为：10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg

2.5 复合PCR的特异性检测

以AIV、IBV、NDV、IBDV、ILTV、FPV、MDV的核酸为模板，应用建立的复合PCR方法进行扩增，检测该复合PCR的特异性。结果显示，单独扩增IBV、NDV、IBDV和AIV的核酸全部出现与预期相符的目的片段，而单独扩增ILTV、FPV、MDV的核酸均没有扩增出任何条带，与此同时混合7种病毒核酸的复合PCR体系只扩增出与设计相符的AIV、IBV、NDV、IBDV核酸的特异性扩增条带(图6)。

M：DNA Marker； 1—4：分别为AIV、IBDV、NDV、IBV；5：IBV+NDV+AIV+IBDV+MDV+FPV+ILTV；6—8：分别为MDV、FPV、ILTV

2.6 复合PCR的简化结果

对建立的复合PCR进行简化改进，即将退火—延伸合并为一个温度，探索退火—延伸的最佳温度，试验温度分别设为56、58、60、62、64、66、68、70 ℃。扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火—延伸(56、58、60、62、64、66、68、70 ℃)40 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃结束反应。结果显示，退火—延伸温度在62 ℃时最佳(图7)。

M：DNA Marker； 1—8：退火—延伸温度分别为56、58、60、62、64、66、68、70 ℃

3 结论与讨论

一种高效复合PCR检测方法的建立，涉及多种因素，如特异性引物、退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶使用量等。最关键的因素是引物设计，与常规PCR引物设计相比，其对引物的要求更高[17]，引物不仅要具有特异性、敏感性、无二聚体，而且要确保引物对之间有相近的退火温度；同时兼顾复合PCR扩增片段的大小，确保各病毒模板的扩增片段在电泳图谱上能够更直观方便地区分。引物浓度和TaqDNA聚合酶使用量同样有至关重要的作用，对复合PCR体系进行优化，可使建立的复合PCR体系对所检测的病毒更具敏感性。特异性和敏感性是复合PCR方法成功建立的标志，由于复合PCR反应体系中多对引物会竞争结合扩增，存在引物之间产生干扰的可能性，引物对越多，干扰的可能性就越大，引物设计严谨才可避免或降低这种干扰。本研究从设计的12对引物中筛选出匹配最佳的4对特异性引物，其Tm值范围相近，目的片段大小存在明显差异(146、215、345、435 bp),为复合PCR扩增条件的优化奠定了基础；建立的复合PCR方法特异性强、敏感性高，AIV、IBV、IBDV检出限为100 pg，NDV为100 fg。

常规PCR的扩增，包括模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火、引物的延伸。其中TaqDNA聚合酶活性最适温度为70～75 ℃，在此温度下延伸速度为150～300 bp/s，60～70 ℃时为60～120 bp/s。若试验扩增的目的片段较短(100～500 bp)，反应混合物在变性温度(94 ℃)和退火温度(50 ℃)之间过渡时，已达到了TaqDNA聚合酶的最适温度，可以在短时间内充分延伸形成所需产物片段[18]。因此，本试验根据常规PCR技术原理，对已完成的复合PCR(三步法热循环步骤)进行改进，将退火和延伸合并为一步，缩短了PCR的反应时间，且试验探索的退火—延伸最佳温度为62 ℃，比三温复合PCR的退火温度(56 ℃)高，所得产物的特异性高，各引物与模板的结合更为准确和稳定，扩增条带更清晰。不仅提高了对AIV、IBV、NDV和IBDV的诊断速度，为有效控制疫病争取了宝贵的时间，而且为鸡主要RNA病毒性疫病病原的快速准确检测奠定了基础。

[1] 李潭清.鸡传染性法氏囊病的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(35):15481-15484.

[2] 刘惠莉,陆承平,朱伟云.鸡传染性支气管炎病毒的RNA干扰[J].中国病毒学,2005,20(3):272-276.

[3] 谭伟,徐倩,谢芝勋.禽流感病毒研究概述[J].基因组学与应用生物学,2014,33(1):194-199.

[4] 程相朝,张春杰,李慧琴,等.新城疫病毒的分子生物学诊断技术[J].河南农业科学,2004(9):76-79

[5] 樊振华,王娟萍,孟帆,等.猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用[J].山西农业科学,2012,40(10):1102-1106.

[6] 金宇良.PCR技术的研究进展[J].现代农业科技,2012(10):47-49.

[7] 黄溢泓,韦正吉,李志源.多重PCR技术在动物病原检测中的应用[J].广西农业科学,2009,40(4):423-427.

[8] 庞耀珊,谢芝勋.二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法的建立[J].中国兽医科技,2001，31(5):4-7.

[9] 邵西群,邵群,闫喜军.大数量序列的PCR保守引物设计实践[J].生物信息学,2007,8(4):171-175.

[10] 尤超,赵大球,梁乘榜.PCR引物设计方法综述[J].现代农业科技,2011(17):48-52.

[11] 赵绪永,宁豫昌,赵丽,等.多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立[J].河南农业科学,2013,42(2):123-127.

[12] 黄溢泓,韦正吉,李志源.五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用[J].中国兽医科学,2010,40(2):164-168.

[13] Xu X G,Chen G D,Huang Y,etal.Development of multiplex PCR for simultaneous detection of six swine DNA and RNA viruses[J].Journal of Virological Methods,2012,183(1):69-74.

[14] Guang H F,Liu M D.Establishment of a multiplex RT-PCR assay to detect different lineages of swine H1 and H3 influenza A viruses[J].Virus Genes,2010,41(2):236-240.

[15] 路斌,王一成,吴润.猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].华北农学报,2010，25(6):38-43.

[16] Sun D B,Wu R,He X J,etal.Development of a multiplex PCR for diagnosis ofStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacilluscereusfrom cows with endometritis[J].Agricultural Sciences in China,2011,10 (10):1624-1629.

[17] Zhi XS,Xie L J.Simultaneous typing of nine avian respiratory pathogens using a novel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J].Journal of Virological Methods,2014,207(3):188-195.

[18] V Balamurugan A S,Saravanan P.One-step multiplex RT-PCR assay for the detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples[J].Veterinary Research Communications,2006,30(6):655-666.

Establishment of Multiplex PCR Detection Method for Four Kinds of Avian Main RNA Viral Diseases

LIU Yuan1,LI Xuewu2,WANG Li2,GU Yu3,WANG Linjian3

(1.College of Animal Science and Technology,Henan Science and Technology University,Luoyang 471023,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Veterinary Medicine and Animal Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Specific primers were designed upon gene conservative sequence in GenBank as well as the gene of avian influenza virus(AIV),avian infectious bronchitis virus(IBV),newcastle disease virus(NDV) and infectious bursal disease virus(IBDV) genomic nucleotide.Biological software were uesd to design 3 pairs of specific primers in the conserved sequence of each kind of virus,12 pairs of primers were designed for 4 viruses,12 pairs of primers was simulated screened,and 4 pairs of primers were appropriate.Optimal annealing temperature,concentration of primers andTaqDNA polymerase concentration were determined to optimizated multiplex PCR reaction conditions.The specificity test,sensitivity test and simplified PCR test were used to establish the simple multiplex PCR detection method.The results showed that specific bands at lengths of IBV(146 bp),NDV(215 bp),IBDV(345 bp) and AIV(435 bp) respectively were amplified by the developed quadruple PCR,which were consistent with those expected.It indicated that high specificity and sensitivity of the developed method,which could detect 100 pg AIV,IBV,NDV IBDV cDNA and 100 fg NDV cDNA.According to the classical principle of PCR technology,the composite PCR(three step thermal cycle step)was improved,which annealing and extension step were merged into one step,and the optimum temperature of annealing-extension was 62 ℃,which could reduce the reaction time.

AIV; IBV; NDV; IBDV; RNA virus; multiplex PCR

2016-05-20

公益性行业(农业)科研专项(201303033)

刘 媛(1991-)，女，河南漯河人，在读硕士研究生，研究方向：分子病原学和免疫学。E-mail：862424624@qq.com

S855.3

A

1004-3268(2016)11-0105-05