1株耐高温产蛋白酶细菌的筛选鉴定及其液体发酵条件的优化

敖 静，桓明辉，李 杨，刘晓辉，高晓梅，徐 冲

(辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 122000)



1株耐高温产蛋白酶细菌的筛选鉴定及其液体发酵条件的优化

敖 静，桓明辉，李 杨，刘晓辉，高晓梅，徐 冲

(辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 122000)

为高效发酵鸡粪，在鸡粪发酵高温时期(≥50 ℃)筛选到11株菌株，确定其中1株高温细菌GX7具有较高的蛋白酶活力。经16S rDNA测序并进行同源性比较可知，GX7与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的16S rDNA 序列相似性达到100%；通过构建系统发育进化树，结合生理生化试验，鉴定GX7为枯草芽孢杆菌。通过绘制细菌生长曲线、测定细菌蛋白酶活力可知，细菌GX7的蛋白酶活力与菌数呈强正相关。从发酵培养基的组成及菌株的培养条件等方面优化枯草芽孢杆菌GX7产蛋白酶的条件，结果显示，最优培养基配方为：酵母浸膏1.5%、玉米粉1.5%、MgSO40.5%；最优培养条件为：pH值8.1、培养温度37 ℃、接菌量2%、装液量50 mL(250 mL)、摇床转速140 r/min。在此条件下，活菌数提高1个数量级，达到2.56×109cfu/mL，蛋白酶活力提高约3倍，为26 U/mL。

耐高温; 蛋白酶; 细菌; 鉴定; 发酵条件优化

随着畜禽养殖业的不断发展，畜禽粪便的产量也急剧增加。据统计，我国畜禽粪便的年总量高达20亿t，是工业废弃物的3.2倍[1]。利用微生物菌剂进行堆肥发酵是将畜禽粪便无害化处理的最有效手段之一。堆肥发酵是微生物通过代谢繁殖将有机质分解转化为无机态养分的过程，通过添加外源微生物能大幅度提高堆肥腐熟的速度和效果[2]。近年来，我国学者在利用微生物发酵堆肥方面进行了大量研究，其中，石春芝等[3]用鸡粪、猪粪和稻壳混合堆肥，通过添加0.5%的快速发酵菌剂，显著缩短了发酵时间，堆制14～21 d即达到有机肥料标准；高华等[4]利用自行分离筛选的菌株复合作为除臭菌剂，对鸡粪进行对比发酵，试验结果发现，0～10 d时，氨气释放量减少了21%，同时硫化氢的产生也有所减少，通过添加除臭菌剂提早20 d消除了臭味，除臭效果明显；席北斗等[5]发现，添加高效复合微生物菌剂的成品肥料含有大量有益菌群，是一种良好的生物活性肥料。生物有机肥中含有许多功能菌，如产纤维素酶菌株、产淀粉酶菌株等，分离筛选具有特定功效的功能菌并将其用于发酵堆肥具有重要意义。目前，关于从发酵鸡粪中筛选具有较高蛋白酶活力菌株的研究鲜见报道，为此，本研究在鸡粪发酵高温时期筛选产蛋白酶菌株，并对其生长条件进行优化，旨在为鸡粪发酵奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 鸡粪 由辽宁省微生物科学研究院微生物实验室采集保存。

1.1.2 培养基配置 NA培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，pH值7.0～7.2，121 ℃高温灭菌30 min。

酪蛋白培养基：干酪素1%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、琼脂1.5%～2%、酵母浸膏0.1%，pH值7.0～7.5，121 ℃高温蒸汽灭菌30 min。

基础发酵液培养基：蔗糖1%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，pH值7.0～7.2，121 ℃高温灭菌30 min[6]。

液体摇瓶培养条件：pH值7.0、37 ℃、转速180 r/min、装液量50 mL(250 mL)、接菌量2%[7]。

1.1.3 仪器 主要有可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，T6新悦)、立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，LDZX-75KB)、恒温摇床(上海世平实验设备有限公司，SPF-2008)。

1.2 菌种初筛

取样方法：鸡粪自然堆肥发酵，高温阶段(≥50 ℃)从粪堆的不同深度部位取样3份，将3份样品充分混合后，称取1.0 g置于99 mL无菌水中，振荡约30 min。梯度稀释至10-5倍，分别利用划线法于NA培养基上(50±2)℃倒置培养24 h[8]。从中挑选形态不同的单菌落，利用平板划线法将其纯化。

1.3 蛋白酶活力测定

定性分析：将分离出的所有菌株点接在酪蛋白培养基平板上，于(50±2)℃培养，每4 h观察1次，至48 h结束。挑选透明圈明显的菌株，测量其菌落直径与透明圈直径[9]。

定量分析：采用福林酚法[10]测定蛋白酶活力。

1.4 鉴定方法

1.4.1 生理生化鉴定 将菌株按划线法接到NA培养基平板上，进行革兰氏染色，观察菌落形态及生长状态[11-12]，并对分离得到的菌株进行生理生化试验。

1.4.2 16S rDNA序列比对及系统发育分析 16S rDNA测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。将16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，利用Mega软件进行比对并构建系统发育进化树。

1.5 培养时间对菌数及产酶活力影响的测定

取14个装有50 mL NA培养基的250 mL三角瓶，用记号笔分别标明培养时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28、32 h。吸取1 mL菌种(37 ℃、180 r/min培养24 h)分别加入14个三角瓶中，液体摇瓶培养条件培养，并按标注的培养时间取相应的三角瓶，立即放入冰箱中冷藏，每个时间点做3个平行处理[13]。以未接菌的NA培养基为空白对照，测OD600值，并计算每个时间点蛋白酶活力。

1.6 液体培养基优化单因素试验及正交试验

采用液体摇瓶培养条件培养，培养时间12 h，用稀释平板计数法计活菌数。每个处理设3个平行。

1.6.1 碳源 分别用1%的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉替代基础发酵液培养基中1%的蔗糖。

1.6.2 氮源 分别用1%的硝酸钠、氯化铵、酵母浸膏、黄豆饼粉替代基础发酵液培养基中1%的蛋白胨。

1.6.3 无机盐 分别用0.5%的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、K2HPO4+KH2PO4(1∶1)替代基础发酵液培养基中0.5%的NaCl[14]。

1.6.4 正交试验设计 根据筛选出的最优碳源、氮源和无机盐3个重要因素，选用三因素三水平L9(33)正交表进行正交试验，以进一步优化，每个处理设3个平行[15]，正交试验设计见表1。

表1 GX7液体培养基优化的正交试验设计 %

1.7 液体培养条件的优化

以优化后的最优培养液配方培养，培养时间12 h，用稀释平板计数法计活菌数。每个处理设3个平行。

1.7.1 初始pH值 将初始pH值用20% NaOH和0.5 mol/L HCl分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0(未调前培养基pH值为4.6)。接种量为1 mL，装液量为50 mL(250 mL)，于恒温摇床中37 ℃、180 r/min振荡培养。选出菌数较高pH值为6.0～8.0，在此范围内将pH值调至6.6、6.9、7.2、7.5、7.8、8.1、8.4，研究细化pH值对菌数的影响。

1.7.2 培养温度 培养温度分别设定为25、30、35、40、45、50、55 ℃，其他培养条件同上。

1.7.3 接种量 将接种量分别设为1%、2%、3%、4%、5%，其他培养条件同上。

1.7.4 装液量 250 mL三角瓶中装液量分别设为10、25、50、75、100 mL，其他培养条件同上。

1.7.5 摇床转速 转速分别设为60、100、140、180、220 r/min，其他培养条件同上。

2 结果与分析

2.1 试验用菌株的初步筛选及产酶活力大小定性比较

试验共分离纯化出11株菌株，分别编号GX1—GX11(表2)。

D/d值较高说明菌株分解酪蛋白能力较强。由表2可以看出，细菌GX7 D/d为3.00，分解酪蛋白能力比其他菌株强。

表2 菌株GX1—GX11分解酪蛋白能力测定结果

2.2 试验用菌株蛋白酶活力大小定量比较

根据图1或用回归方程计算得出，当吸光度为1时，酪氨酸的量为97.9 μg，即吸光常数K值为97.9。从图2可以看出，高温细菌中GX7的蛋白酶活力最高，约为9 U/mL，而其他菌株的蛋白酶活均在4 U/mL以下。

图1 L-酪氨酸标准曲线

图2 细菌蛋白酶活力比较

2.3 细菌GX7形态学特征比较及生理生化试验

细菌GX7形态学特征为菌落小、白色、形状不规则、表面起褶皱、边缘锯齿状、不产色素；有芽孢、椭圆形、中生；杆状，革兰氏染色呈阳性。根据《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定细菌GX7为芽孢杆菌属。

从表3可以看出，细菌GX7生化试验结果为：葡萄糖产气、不产酸，麦芽糖、硝酸盐还原、明胶液化、VP等试验结果阳性，乳糖、西蒙氏柠檬酸盐、吲哚等试验结果阴性，符合芽孢杆菌属的生化特征。

表3 细菌GX7的生化特征

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.4 细菌GX7的16S rDNA 序列比对

使用BLAST将GX7的16S rDNA序列提交到 NCBI 核酸数据库中，与数据库中其他菌的16S rDNA序列进行比对。结果表明，GX7与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的16S rDNA 序列相似性达到100%，可以初步确认细菌GX7为枯草芽孢杆菌。

从GenBank中选择8个菌株与GX7构建系统发进化育树。如图3所示，菌株GX7与Bacillussubtilisstrain TAT1-8亲缘关系最近，进一步证明GX7为枯草芽孢杆菌。

图3 细菌GX7的16S rDNA系统发育进化树

2.5 细菌GX7的生长曲线及酶活力变化曲线

生长曲线是反映菌体生长状态的曲线，分为4个阶段：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期，通过生长曲线可以判断菌株的最佳培养时间。从图4可以看出，细菌GX7培养12 h内菌数逐渐升高，蛋白酶活力也随之增高；超过12 h后，菌数开始降低，酶活力也随之降低；培养至12 h时，OD600值最高，即菌数最多，所以最佳培养时间为12 h。

图4 培养时间对GX7的菌数及产酶活力的影响

从图5可以看出，酶活力与菌数关系密切。GX7的蛋白酶活力与菌数的相关系数r=0.984，表明细菌GX7的蛋白酶活力与菌数呈强正相关(r>0，为正相关，且r>0.8，为强正相关)。因此，培养基优化可将菌数高低作为衡量标准。

图5 GX7蛋白酶活力与菌数的相关性

2.6 细菌GX7液体培养基的优化

2.6.1 单因素试验结果

2.6.1.1 碳源对活菌数的影响 从图6可以看出，玉米粉和可溶性淀粉为碳源时，GX7的生长明显优于葡萄糖、乳糖和蔗糖；利用玉米粉和可溶性淀粉作为碳源发酵后，GX7活菌数超过2.87×108cfu/mL。而利用其他3种碳源时，其活菌数在0.85×108cfu/mL以下，说明GX7利用淀粉的能力优于单糖和二糖，利用玉米粉的能力优于可溶性淀粉。可见，GX7生长的最佳碳源是玉米粉，其次是可溶性淀粉。

图6 不同碳源对活菌数的影响

2.6.1.2 氮源对活菌数的影响 从图7可以看出，酵母浸膏、黄豆饼粉和蛋白胨为氮源时，GX7的生长明显优于硝酸钠和氯化铵，其活菌数可达到6.22×108cfu/mL以上， 说明GX7利用有机氮源的能力优于无机氮源。利用有机氮源的能力依次为酵母浸膏>黄豆饼粉>蛋白胨，这与酵母浸膏中富含氨基酸、维生素及未知生长因子有关[16]。可见，GX7生长的最佳氮源是酵母浸膏。

图7 不同氮源对活菌数的影响

2.6.1.3 无机盐对活菌数的影响 从图8可以看出，Zn2+和Fe2+对GX7的生长略有抑制作用，菌数均低于NaCl； MgSO4对GX7的生长有明显的促进作用，其活菌数可达到4.26×109cfu/mL；K2HPO4与KH2PO4(1∶1)混合时，GX7的活菌数达到1.58×109cfu/mL，说明K+对GX7的生长有一定的促进作用，也可能是由于K2HPO4和KH2PO4形成了缓冲溶液，对溶液的pH值产生了一定的缓冲作用，导致菌数增多。可见，GX7生长的最佳无机盐为MgSO4。

图8 不同无机盐对菌数的影响

2.6.2 正交试验结果 确定最佳碳源是玉米粉，最佳氮源是酵母浸膏，最佳无机盐是MgSO4，选用三因素三水平L9(33)正交表进行试验，结果见表4。

表4 GX7液体培养基优化的L9(33)正交试验结果

通过正交试验可知，RB>RA>RC，3个因素对试验结果的影响顺序为B>A>C，利用数据统计软件SPSS计算得FA=3.330，FB=4.657，FC=0.214，即酵母浸膏(B)在这3个因素中影响最大，玉米粉(A)次之， MgSO4(C)最小。由表5可以得出，最优配方为A3B3C2，即酵母浸膏1.5%、玉米粉1.5%、MgSO40.5%。

2.7 细菌GX7液体发酵条件的优化

2.7.1 培养基初始pH值对活菌数的影响 从图9可以看出，随着pH值的升高，细菌GX7活菌数随之增加，当pH值为8.1时，活菌数最高；当pH值大于8.1时，细菌GX7活菌数有所下降。因此，确定GX7 的最适pH值为8.1。

图9 不同初始pH值对活菌数的影响

2.7.2 培养温度对活菌数的影响 从图10可以看出，25～35 ℃，细菌GX7的活菌数随温度升高而增加；当温度超过40 ℃时，细菌GX7的活菌数随温度升高而减少，但由于GX7在高温条件下筛选出，所以，温度升高到55 ℃时，仍有活菌。可见，细菌GX7的最适生长温度是35～40 ℃，根据试验具体情况，选用细菌常用培养温度37 ℃。

图10 不同培养温度对活菌数的影响

2.7.3 接菌量对活菌数的影响 从图11可以看出，接菌量小于3%时，细菌GX7的活菌数随接菌量的增加略有增加；当接菌量大于3%时，活菌数有所下降，说明接种量过大或者过小都会影响到活菌数，过小会造成细菌长势较慢，过大又会引起溶氧或营养物质不足而导致菌数减少。因此，最佳接菌量为2%～3%。接菌量为2%和3%时，菌数相差较小，因此，确定GX7液体培养最佳接菌量为2%。

图11 不同接菌量对活菌数的影响

2.7.4 装液量对活菌数的影响 从图12可以看出，250 mL三角瓶中装液量小于50 mL时，菌数随装液量的增加而增加；而装液量超过50 mL以后，菌数开始减少。由此可知，装液量的多少对菌株的生长有一定影响，装液量过少营养物质不足，不利于菌株生长；装液量过大则通氧量减少，导致菌数下降[17]。因此，细菌GX7的液体培养最佳装液量为50 mL(250 mL)。

图12 不同装液量对活菌数的影响

2.7.5 转速对活菌数的影响 从图13可以看出，振荡培养箱转速小于140 r/min时， 菌数随转速的加快而增加；当转速大于140 r/min时，菌数基本保持不变。由此可知，当转速过小时，培养基通氧量不足，不利于菌株生长；当通氧量达到菌株生长所需的极限时，转速虽然增加，但菌数基本保持不变。因此，确定GX7液体培养最佳摇床转速为140 r/min。

图13 不同转速对活菌数的影响

配方优化前，GX7的菌数为0.85×108cfu/mL；蛋白酶活力为9 U/mL。通过以上试验，在最佳培养条件下，GX7的菌数提高至2.56×109cfu/mL；蛋白酶活力为26 U/mL，比优化前提高了约3倍。

3 结论与讨论

蛋白质是鸡粪的主要物质之一，其中粗蛋白含量为25%～35%[14]，本研究以筛选具有降解蛋白质功能的细菌为目的，在鸡粪发酵高温期时(≥50 ℃)筛选到11株高温菌株，确定了1株高温细菌(GX7)具有较高蛋白酶活力，经过16S rDNA测序并进行同源性比较可知，GX7与枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列相似性达到100%，通过构建系统发育进化树，并结合生理生化试验，鉴定GX7为枯草芽孢杆菌。

本研究确定了酶活力与菌数的关系，优化培养基提高菌数的同时也提高蛋白酶活力。利用优化的培养基配方，在优化后的培养条件下培养，活菌数由0.85×108cfu/mL提高至2.56×109cfu/mL，蛋白酶活力由9 U/mL提高至26 U/mL，提高了约3倍。有效菌数多可以抑制其他细菌的生长，在鸡粪发酵时解决了其他有害杂菌过多的问题，而且能提高发酵效率，缩短鸡粪发酵时间；同时，蛋白酶活力的提高更有利于鸡粪中蛋白质的分解，能够提高发酵后的有效肥效，增加肥力。本研究为进一步研究高温蛋白质降解菌的应用奠定了理论基础。

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Screening and Identification of A High Temperature Resistance Protease-producing Bacteria and Optimization of Its Liquid Fermentation Condition

AO Jing,HUAN Minghui,LI Yang,LIU Xiaohui,GAO Xiaomei,XU Chong

(Microbial Research Institute of Liaoning Province,Chaoyang 122000,China)

To improve chicken manure fermentation,11 strains were screened in chicken manure fermentation during the period of high temperature(≥50 ℃),of which thermophilic bacteria GX7 with high protease activity by 16S rDNA sequencing and homology comparison,the sequence homology of GX7 withBacillussubtilisof 100%.GX7 was identified asBacillussubtilisby phylogenetic tree and combined with physiological and biochemical tests.By drawing the bacterial growth curve and determining the bacterial protease activity,it could be known that the protease activity of GX7 was strongly positively correlated with the number of bacteria.By optimization of culture medium composition and strain culture conditions,the optimal medium was yeast extract of 1.5%,corn powder of 1.5%,MgSO4of 0.5%;The optimum culture condition was pH value of 8.1,culture temperature of 37 ℃,inoculation amount of 2%,liquid volume of 50 mL(250 mL),shaker speed of 140 r/min.Under these conditions,the number of viable bacteria increased 10 times to 2.56×109cfu/mL,and the protease activity increased three times to 26 U/mL.

high temperature; protease; bacteria; identification; fermentation condition optimization

2016-05-01

敖 静(1986-)女，辽宁朝阳人，助理研究员，本科，主要从事微生物菌种选育工作。E-mail：aojing07@163.com

S811.7

A

1004-3268(2016)11-0116-07