没食子酸对恩诺沙星在鲤体内的药代动力学及残留的影响研究

李改娟,刘艳辉,陈伟强,祖岫杰,戴 欣,赵全东,杨炳坤

(1.吉林省水产科学研究院,吉林长春130033;2.松辽流域水资源保护局,吉林长春130021)

没食子酸对恩诺沙星在鲤体内的药代动力学及残留的影响研究

李改娟1,刘艳辉1,陈伟强1,祖岫杰1,戴 欣2,赵全东1,杨炳坤1

(1.吉林省水产科学研究院,吉林长春130033;2.松辽流域水资源保护局,吉林长春130021)

为研究没食子酸与恩诺沙星联合用药及单用恩诺沙星在福瑞鲤Cyprinus carpio体内的药代动力学参数及其残留消除规律,采用平行对照试验,将体质量为(200±30)g的鲤随机分为单用恩诺沙星组(对照)和联合用药组(没食子酸与恩诺沙星质量比为10∶1),试验水温为26℃,各组均按2 mg/kg(体质量)剂量的恩诺沙星单次混饲口灌给药,于给药后不同时间点采集鲤血浆、肌肉、肝胰脏、肾脏组织,采用高效液相色谱法测定各组织中恩诺沙星的浓度,并使用DAS 3.0药物代谢动力学软件的非房室模型统计矩方法分析药时数据。结果表明,没食子酸能显著增大鲤各组织对恩诺沙星的吸收效率,提高有效药物浓度20.0％～44.9％,并加快了恩诺沙星的代谢和消除,240 h时联合用药组鲤血浆、肌肉组织中药物残留量比对照组分别降低了44.2％和34.1％。

鲤;恩诺沙星;没食子酸;联合用药;药代动力学;残留

水产养殖病害问题一直是制约水产养殖业发展的瓶颈,尤其是细菌性疾病的流行与暴发,给水产养殖者造成了严重的经济损失。生产过程中对症下药固然能起到预期的效果,但同时也带来了诸如药物残留影响水产品安全和大量用药使病原体产生耐药性等一系列问题。因此,在生产中研制高效安全的抗病药物是目前亟待解决的难题。中草药具有抑菌无残留、无耐药性、诱食和提高免疫力等作用[1],克服了化学药物和抗生素类药物的缺陷,但中草药也存在用药剂量大、疗效慢等缺点。中西药联合应用弥补了中草药和抗菌素单味用药的不足,既可增强治疗效果、降低耐药性的产生,又可保护环境、减少药物残留[2],具有较好的发展前景。卢静等[3]对中药单体和抗生素联合用药的药效学进行了研究,发现将没食子酸和恩诺沙星联合用药,克服了上述单一用药的缺点,且该联合用药对嗜水气单胞菌具有相加抑菌作用,对温和气单胞菌具有协同抑菌作用。在此基础上,本研究中对没食子酸和恩诺沙星联合用药与单用恩诺沙星在鲤体内吸收、分布和消除情况进行了比较,探讨了中药没食子酸对恩诺沙星药物代谢及残留的影响,为制定合理的给药方案和休药期提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼为长春市九台水产良种场提供的福瑞鲤Cyprinus carpio,体质量为(200±30)g,试验前一周暂养在水族箱内。

试验仪器主要有Waters ACQUITY UPLC超高液相色谱仪、XiangYi L-550离心机和IKA MS3 digital振荡器。

试验药品主要有乙腈(色谱纯),KH2PO4、NaOH、HCOOH(均为分析纯),恩诺沙星标准品由中国兽药监察所提供,恩诺沙星原药粉(含量不少于98.0％)由中国西安瑞特动物药业有限公司提供,试验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 用流动相配制浓度为100μg/mL的恩诺沙星标准储备液,于冰箱中(4℃)避光保存。临用前,分别用流动相稀释配制成浓度为0.01、0.05、0.10、2.00、20.00、100.00μg/mL的系列标准工作液。

1.2.2 混饲口灌给药及样品采集[4-5]试验设联合用药组和单用恩诺沙星组(对照组),在水温为26℃条件下,中西药联合用药组按没食子酸和恩诺沙星质量比为10∶1混合溶解后混入饲料中,加水搅拌成糊状,配制成一定浓度,单次混饲口灌给药[以恩诺沙星计,剂量为2 mg/kg(体质量)];单用恩诺沙星的对照组按2 mg/kg(体质量)的剂量单次混饲口灌给药。灌入试验鱼前肠后,无回吐者保留用于试验,于给药后0.17、0.33、0.50、0.75、1、2、4、6、12、16、24、72、144、288、384、480 h分别从每组取6尾鱼,自尾静脉采集血样,将血样置于含1％肝素的离心管中混匀、离心,分离上清液血浆,同时将鱼处死,取其肌肉、肝胰脏、肾脏等组织,将所采集的血浆及组织样品于冰箱(-20℃)中避光保存待测。

1.2.3 样品前处理

(1)血浆样品[6]。准确吸取0.3 mL血浆样品放入离心管中,依次向离心管中加入0.5 mL甲酸水溶液(0.1％)和甲醇,漩涡震荡2 min,以8000 r/min离心5 min,上清液过0.22μm滤膜后待测。

(2)肌肉、肝胰脏、肾脏样品。称取捣碎的组织样品(2.0±0.1)g置于50 mL塑料离心管中,加入10 mL酸化乙腈,漩涡震荡2 min,超声15 min,以4000 r/min离心10 min,将上清液转移到鸡心瓶中,在残渣中加入10mL酸化乙腈重复提取一次,合并上清液至鸡心瓶中,45℃下水浴减压旋转蒸干,用1 mL流动相溶解残余物,加入1 mL正己烷去除脂肪,水相经0.22μm滤膜过滤后待测。

1.2.4 液相色谱测定条件 Waters ACQUITY UPLC液相色谱仪的色谱柱为Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱温为35℃;流动相为0.1％甲酸水溶液∶乙腈(体积比为90∶10),流速为0.5 mL/min,进样体积为5μL,荧光检测器, λex为280 nm,λem为450 nm。

1.3 数据处理

使用SPSS软件对试验数据进行分析处理,采用DAS 3.0软件进行药代动力学参数及模型拟合。

2 结果与分析

2.1 方法的可靠性评价

按“1.2.3”节中的方法,对血浆、肌肉、肝胰脏和肾脏空白样品进行前处理后,空白样品在恩诺沙星出峰处无干扰,标样色谱峰尖锐且对称,检出限、线性范围、回收率、精密度均达到试验要求。

2.1.1 线性范围、检出限和定量限 分别取1.0、5.0、10.0、20.0、200.0μL恩诺沙星标准液于容量瓶中,用流动相定容至100 mL,并用液相色谱仪进行测定,以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归分析,恩诺沙星浓度为0.01～100 μg/mL时有良好的线性关系,相关系数R2= 0.9999。根据加标试验结果,其检出限(S/N≥3)血浆样品为0.01μg/mL,肌肉、肝胰脏、肾脏样品为2μg/kg,其定量限(S/N≥10)血浆样品为0.03μg/mL,肌肉、肝胰脏、肾脏样品为5 μg/kg。

2.1.2 准确度与精密度 对福瑞鲤空白血浆、肌肉、肝胰脏、肾脏分别进行标准添加试验,添加浓度分别相当于其定量检出限的1、3、10倍。上述样品经“1.2.3”节前处理后上机测定,1 d内测定6次,连续测定6 d,分别计算各批次日内和日间的变异系数和回收率。结果表明,血浆回收率为90％～110％,其他组织为85％～110％,测定的日内和日间变异系数为2.0％～4.5％。

2.2 恩诺沙星在鲤血浆中的药代动力学特征

采用DAS 3.0软件对两组试验中恩诺沙星在血浆中的浓度进行非房室模型统计矩参数分析,得到药代动力学参数及血浆中的药-时曲线如表1和图1所示。

表1 恩诺沙星在福瑞鲤血浆中的药物代谢动力学参数Tab.1 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in common carp adm inistered orally under different conditions

2.3 联合用药和单用恩诺沙星在鲤不同组织中的吸收与分布

联合用药和单用恩诺沙星后,可获得恩诺沙星在鲤肌肉、肝胰脏、肾脏中的药-时曲线见图2。

图1 恩诺沙星在福瑞鲤血浆中的药-时曲线Fig.1 M ean enrofloxacin concentration in plasma of common carp adm inistered orally at a dose of 2 mg/kg(body weight)

图2 恩诺沙星在福瑞鲤肌肉、肝胰脏、肾脏中的药-时曲线Fig.2 M ean enrofloxacin concentration in muscle,hepatopancreas,and kidney of common carp adm inistered orally at a dose of 2 mg/kg(body weight)

2.3.1 肌肉中的药物含量 从图2可见:肌肉中两组均在8 h时达到药物高峰,联合用药组和对照组峰值分别为1.85、1.31 mg/kg;24 h时,药物含量分别为0.91、0.68 mg/kg;240 h时,药物含量分别为0.27、0.41 mg/kg。可以看出,联合用药组恩诺沙星浓度比对照组高,提高了有效浓度,72 h后,联合用药组鲤肌肉中的恩诺沙星浓度则低于对照组,这与血浆中恩诺沙星的药-时曲线(图1)消除趋势相同,表明该组的消除速率高,即没食子酸加速了恩诺沙星在鲤肌肉中的代谢,降低了残留。

2.3.2 肝胰脏中的药物含量 从图2可见:肝胰脏中联合用药组恩诺沙星的含量在1 h时达到药物高峰(7.94 mg/kg),对照组恩诺沙星含量则在0.75 h时达峰(5.48 mg/kg),联合用药组较对照组达峰时间稍晚,且峰值较大,为对照组的1.45倍;24 h时,联合用药组和对照组鲤肝胰脏中恩诺沙星的含量分别为1.49、1.43 mg/kg;24 h后,两组试验中恩诺沙星在肝胰脏内的含量相当。可以看出,联合用药提高了恩诺沙星在鲤肝胰脏中的消除速率。

2.3.3 肾脏中的药物含量 从图2可见,肾脏中联合用药组和对照组恩诺沙星的含量均在2 h时达到药物高峰,峰值分别为6.24、5.20 mg/kg;恩诺沙星含量在达峰之后,两组均处于快速消除阶段,且直至240 h时两组中含量一直相差不大。

3 讨论

3.1 检测方法

本试验中,恩诺沙星的测定方法是根据农业部783号公告[7]并进行了部分变动,用0.1％甲酸水溶液取代了四丁基溴化铵,提高了灵敏度,同时避免了盐类或离子对试剂的使用,因其与乙腈、甲醇混合使用易引起色谱管路堵塞[8]。检测仪器使用了超高效液相色谱仪,减少了流动相的消耗,降低了对环境的污染。

3.2 药代动力学参数

本试验中,鲤单次混饲口灌联合用药与单用恩诺沙星相比,血浆中恩诺沙星的含量达峰时间一样,均为45 min,但联合用药组峰值为1.97 μg/mL,明显比对照组(1.38μg/mL)高,导致半衰期有所延长,同时药时曲线下面积也明显增大,表明没食子酸增强了鲤对恩诺沙星的吸收效率,使恩诺沙星的有效药物浓度增大,生物利用度提高。联合用药组的表观分布容积明显大于对照组,表明没食子酸可增大恩诺沙星在鲤体内分布,与半衰期的长短相一致。从图1可知,联合用药组血浆中恩诺沙星含量约24 h时和对照组中相当,导致联合用药组的平均驻留时间明显减小。总体清除率升高,表明没食子酸的添加使恩诺沙星的消除加快,这一现象也与以上结果相一致。

联合用药后,一种药物引起另一种药物药动学参数改变的现象较为常见,中药对西药的药动学会产生一定影响,如银杏叶提取物能显著降低苯巴比妥的血药浓度[9],胡椒碱能显著增大口服苯妥英钠的吸收速率常数,并减小其消除速率常数,提高其血药浓度[10-11]。黄芩苷和甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内的代谢影响,表现为达峰浓度和药时曲线下面积下降,半衰期减小,总体清除率升高[11]等。

3.3 恩诺沙星在鲤各组织中的分布和消除特征

本试验中,联合用药与单用恩诺沙星相比,各组织中的达峰时间均未发生明显变化。两组中达峰时间顺序均为肝胰脏最先,肾脏其次,肌肉最后。联合用药与单用药物两组达峰药物浓度均为肝胰脏(7.94、5.48 mg/kg)最高,肾脏(6.24、5.20 mg/kg)次之,肌肉(1.85、1.31 mg/kg)最低。说明药物主要经肝胰脏吸收,达峰后肝胰脏中的药物含量反而低于肾脏,说明恩诺沙星主要是经肾脏排泄[12];肌肉中的含量仍然最少,这可能是由于肌肉的渗透性差,血管贫乏,而肝胰脏和肾脏渗透性好且血管丰富[13]。虽然两组在各组织中的药物达峰时间无明显变化,但联合用药组各组织中的有效药物浓度比对照组提高了20.0％～44.9％,说明没食子酸能显著增大恩诺沙星的吸收效率;24 h时,联合用药组的血浆和肌肉中药物浓度大于对照组,肝胰脏和肾脏中的药物浓度基本相当;240 h时,联合用药组鲤血浆与肌肉中药物浓度较对照组分别低44.2％和34.1％,说明没食子酸的添加促进了恩诺沙星在鲤体内的代谢和消除,降低了恩诺沙星的残留量。李小彦[14]研究了黄芩苷和诺氟沙星联合用药在对虾体内的残留消除规律,结果表明,黄芩苷加速了诺氟沙星在对虾体内的消除,减少了诺氟沙星的残留。本研究中鲤血浆和个别组织的药时曲线中出现多峰现象,这与一些研究结果[15-17]相符,证明恩诺沙星在鲤体内可能存在再吸收。

近年来,随着耐药性问题的日益突出,中西药联用在水产动物疾病防治中的应用日益受到重视,现已逐渐应用于鱼类细菌和病毒性疾病防治,如三黄散与恩诺沙星合用防治出血病,黄连和诺氟沙星合用防治细菌性烂鳃病[11],相对于单用抗生素类药物,中西药联合应用更能够降低或避免耐药菌的产生[18]。因此,开展中西药配伍的联合应用研究,可为鱼病防治和渔药的合理使用提供科学依据,提高水产养殖防病效果。

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Effects of gallic acid on metabolism and residues of enrofloxacin in common carpCyprinus carpio

LIGai-juan1,LIU Yan-hui1,CHENWei-qiang1,ZU Xiu-jie1, DAIXin2,ZHAO Quan-dong1,YANG Bing-kun1
(1.Jilin Fisheries Research Institute,Changchun 130033,China;2.Water Resource Protection Bureau of Songliao River Basin,Changchun 130021, China)

The common carpCyprinus carpiowith body weight of(200±30)g were randomly divided into two groups and administered orally with enrofloxacin and combination of enrofloxac in and gallic acid(mass ratio of 10∶1)at a dose of 2 mg/kg(body weight)atwater temperature of26℃to study pharmacokinetics and residues of enrofloxacin in common carp.Then the concentration of enrofloxacin were detected in plasma,muscle,hepatopancreas and kidney sampled in different time by high performance liquid chromatography with fluorescence detection.The non-compartmental analysis by DAS 3.0 pharmacokinetic program software revealed that gallic acid led to increase the absorption efficiency of enrofloxacin significantly,to improve the effective drug concentration from 20.0％to 44.9％,and to facility themetabolism and elimination of the drug,reducing the drug residues by 44.2％ in plasma and by 34.1％in muscle in 240 h exposure.

Cyprinus carpio;enrofloxacin;gallic acid;combination of drug;pharmacokinetics;residue

S965.116

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.013

2095-1388(2016)06-0658-05

2016-03-02

吉林省科技引导计划项目(20140417021CB);国家现代农业产业技术体系(CARS-46-29)

李改娟(1982—),女,工程师。E-mail:519101890@qq.com

刘艳辉(1966—),女,研究员。E-mail:Liuyanhui9@163.com