犬瘟热分子生物学诊断技术研究进展

左　楠

(哈尔滨市动物卫生防疫站，哈尔滨 150016)



犬瘟热分子生物学诊断技术研究进展

左楠

(哈尔滨市动物卫生防疫站，哈尔滨 150016)

摘要：犬瘟热是目前危害犬、毛皮动物和野生动物最严重的传染病之一。其临床症状复杂，大多存在混合感染，确诊尤其是早期诊断较为困难。早期诊断对于犬瘟热的综合防控和患病动物的救治具有重要的作用，近年来分子生物学诊断技术的不断发展，对犬瘟热的诊断具有重要意义。现对犬瘟热的分子生物学诊断方法等作一综述。

关键词：犬瘟热；早期诊断；分子生物学

犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、鼬科和浣熊科等多种肉食性动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬瘟热最早发现于18世纪后叶，1905年有人发现其病原为一种病毒。我国于1980年从患病犬体内分离到此病毒[1]。犬瘟热的临床表现多样，特征性的示病症状很少出现，大多存在混合感染，因此准确、快速、特异性强的早期诊断方法在兽医临床中越来越重要。

1病原与症状

CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，为有囊膜的单股、负链RNA病毒，病毒粒子呈多形性，直径一般在100～300nm之间。其抵抗力不强，对热、干燥、紫外线和有机溶剂敏感[2]。

犬瘟热的临床症状依所处环境、感染毒株、感染动物年龄和免疫状态的不同而呈现多样性。病犬主要表现为双相热，呼吸道症状如呼吸道卡他性炎症，神经症状如肌肉痉挛和癫痫等，消化道症状如腹泻、呕吐和脱水等。病程一般为2周或稍长，发生卡他性肺炎和肠炎时病程可能较长，出现神经症状的病程最长。

2常规检测与诊断

依据临床症状和流行病学特点，可作出初步诊断，但犬瘟热病毒常与其他病毒混合感染，或引起细菌的继发感染，因此犬瘟热的临床症状表现复杂，只有将临床症状与实验室诊断相结合才能进行确诊。常见的实验室诊断方法有CDV的分离培养及鉴定、电子显微镜直观观察诊断和血清学检测与诊断等。其中血清学诊断在犬瘟热的实验室诊断中是较为可靠的诊断方法。相继建立起了补体结合实验、微量血清中和实验、免疫荧光试验等检测和诊断方法，其中免疫荧光技术是目前国际通用的犬瘟热诊断方法[3]。

3分子生物学检测与诊断

犬瘟热的确诊较为困难，尤其是早期诊断。但是随着分子生物学的发展，国内外先后建立了犬瘟热的核酸杂交等温扩增等分子生物学诊断技术，其方法比免疫学方法的敏感性和特异性更高，尤其在CDV的感染早期，尚未产生免疫应答的情况下分子生物学方法能够作出早期诊断。

3.1核酸杂交

核酸杂交是一种分子生物学的检测技术，用放射性或非放射性物质标记的已知序列的单链DNA或RNA片段(探针)，检测样品中的DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)，经放射自显影或显色反应将与探针特异性结合的靶序列显示出来，其敏感性高、特异性强。在应用核酸杂交技术对犬瘟热进行诊断方面，国内报道较少，国外研究较多。Appel[4]用DNA探针和单股RNA探针检测了CDV基因组和mRNA，获得了很高的灵敏度和特异性。Zurbriggen等[5]用地高辛标记犬瘟热病毒NP基因互补的RNA作为探针，可检测到单个细胞中存在的犬瘟热核苷酸序列。王宏俊等[6]在CDV基因序列中编码核衣壳蛋白的保守区内设计合成一对特异性引物，通过RT-PCR从CDV基因中扩增出一段430bp的cDNA，并制备出地高辛标记的核酸探针，经检测结果表明该探针可用于CDV的临床检测。

3.2聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(PCR)作为一种体外扩增DNA片段的技术已广泛用于DNA病毒特异性核酸的检测，具有省时、省力、敏感性和特异性高等优点。国内外已有许多通过RT-PCR检测CDV的报道。肖定福[7]等根据CDV的NP基因设计一对引物，使用RT-PCR方法，从临床疑似CDV感染犬的淋巴细胞中检测到目的条带(287bp)，表明该引物与反应条件适合于检测犬CDV感染。张洪亮等[8]根据CDV疫苗株和野毒株H基因序列Nde Ⅰ酶切位点的不同，建立了RT-PCR扩增产物经限制性片段长度多态性分析(RELP)鉴别检测方法，为临床上犬瘟热病毒的鉴别检测和诊断提供了依据。

3.3实时定量PCR

实时定量PCR(Real-time PCR)是在PCR的基础上发展起来的一种新的核酸检测技术，比普通PCR更迅速、灵敏、特异性强。目前实时定量PCR检测方法主要有SYBR Green荧光染料掺入法和TaqMan探针法。TaqMan探针法特异性好，但是价格比较昂贵，染料法价格较为低廉，敏感性、特异性等也较好。黄国君等[9]根据犬瘟热病毒NP基因序列，设计合成引物，建立了基于SYBR Green Ⅰ的Real-time RT-PCR检测CDV的方法，与常规RT-PCR及胶体金检测技术(GIA)进行了比较，结果表明敏感性比常规RT-PCR高103，比GIA高105。检测11例临床病例，检出率100%，为CDV的早期快速诊断提供了新的定量检测方法。全传松等[10]建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，其敏感性是常规RT-PCR的100倍，与其他犬类病毒不发生交叉反应。对67份临床样品检测，阳性检出率为64.2%，高于常规RT-PCR阳性检出率20%，具有良好的敏感性、特异性和稳定性。

3.4环介导等温扩增

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年日本学者Notomi等报道的一种新的恒温核酸扩增技术，是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，在等温条件下(60～65℃)，1h完成核酸扩增。扩增反应产生焦磷酸镁白色沉淀，可通过肉眼来判断是否发生扩增。LAMP技术已在食品检测、临床疾病诊断等领域有着广泛的应用。何丽丽等[11]根据犬瘟热病毒N基因设计2对LAMP引物，建立CDV环介导等温扩增检测方法。经检测，结果显示，该方法敏感性比RT-PCR高10倍，仅CDV产生阳性扩增，狂犬病毒、犬细小病毒和犬腺病毒Ⅱ型扩增结果均为阴性，临床样品检测结果与RT-PCR一致。杨天阔等[12]建立了鉴别CDV野毒株与疫苗株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)，对反应体系和条件进行了优化，方法特异性高，敏感度是常规RT-PCR的100倍。

4小结

犬瘟热作为对毛皮动物、犬和野生动物危害最严重的疾病之一，每年都会造成巨大的经济损失。由于其诊断复杂和困难，需要实验室诊断技术来进行确诊。虽然已有多种诊断方法成功应用于诊断，但在实际推广应用上仍存在一些问题。随着科学技术的不断发展，分子生物学的研究逐渐深入，新的分子生物学技术不断推出和完善，准确、快速、简便的对犬瘟热进行诊断和监测将逐步实现，对于犬瘟热的综合防控和有效治疗，保护毛皮动物养殖业、保障宠物犬和野生动物的健康具有重大意义。

参考文献:

[1] 夏咸柱．养犬大全[M]．吉林：吉林人民出版社，1993:549-553.

[2] 殷震，刘景华．动物病毒学[M]．北京：科学出版社，1997.

[3] 黎映胜．犬瘟热诊断方法的研究进展[J]．甘肃畜牧兽医，2009(6):43-46.

[4] Appel M J. Canine distemper virus infection and encephalitis in javalias[J]. Arch Virol,1991:147-152.

[5] Zurbriggen A, Muller C, Vandenelde M. In Situ hybridization of virulent canine distemper virus in brain tissue using digoxigenin-labeled prober[J]. Am J Vet Res, 1993,54(9):1457-1459.

[6] 王宏俊，丁少忠.核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用[J].中国兽药杂志，2006,40(5):19-22.

[7] 肖定福，张汇东，李文平，等.RT-PCR检测宠物犬的犬瘟热病毒[J].经济动物学报，2005,9(4):221-224.

[8] 张洪亮，张传美，王聪，等.鉴别犬瘟热病毒疫苗株和野毒株RT-PCR-RFLP方法的建立及应用[J].中国兽医学报，2013,33(11):1647-1656.

[9] 黄国君，岳华，杨发龙，等.SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用[J].中国预防兽医学报，2008,30(6):450-454.

[10] 全传松，李博韬，姜骞，等.犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2014,44(6):589-592.

[11] 何丽丽，关玮琨，江馗语，等.犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2013,35(2):138-141.

低产品种下降9%～10%；最初数月下降速度较慢，到泌乳末期，泌乳量迅速下降。初乳期内的乳脂率很高，第2～8周乳脂率最低。第三个泌乳月开始，乳脂率又逐渐上升。

文章编号：2095-9737(2016)01-050-02

中图分类号：S858.292

文献标识码：A

作者简介：左楠(1981-)，男，黑龙江佳木斯人，硕士，兽医师，主要从事动物疫病防控、畜牧兽医技术推广及科研工作。

收稿日期：2015-09-21