云南红豆杉中紫杉烷类化合物的提取工艺优化

徐　芸，沙喜阳，吴　睿，黄士栩，杨文婷

(武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)



云南红豆杉中紫杉烷类化合物的提取工艺优化

徐芸，沙喜阳，吴睿，黄士栩，杨文婷

(武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)

摘要：以云南红豆杉树皮为原料，采用纤维素酶法提取其中的紫杉烷类化合物。以酶处理时间、酶用量、酶处理温度、料液比为考察因素，以紫杉烷类化合物得率为考核指标，通过单因素实验和正交实验对提取工艺进行了优化。结果表明，最佳工艺条件为：酶处理时间1.0 h、酶用量0.6%、酶处理温度45 ℃、料液比1∶16(g∶mL)，在此条件下，紫杉烷类化合物的得率为0.898%。该提取工艺操作简单，提取条件温和、稳定。

关键词：云南红豆杉；纤维素酶；紫杉烷类化合物；正交实验

云南红豆杉(Taxus yunnanensis)为红豆杉科红豆杉属的常绿乔木，又名西南红豆杉，是我国红豆杉四大品种之一[1-3]，主产于云南西北部及西部、四川西南部与西藏东南部[4]。从该植株中可提取紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)等紫杉烷类化合物。紫杉醇作为目前发现的最好的抗癌药物之一，对多种晚期癌症(如卵巢癌和乳腺癌等)有疗效[5-7]。10-DAB具有紫杉烷类化合物母核结构，可以通过测定其含量考察紫杉烷类化合物的得率。红豆杉树皮坚硬，紫杉烷类化合物的提取效率较低，不利于红豆杉资源的充分利用。作者采用纤维素酶法对红豆杉树皮进行处理，以提高其中紫杉烷类化合物的提取效率；以10-DAB得率作为评价指标，考察酶处理时间、酶用量、酶处理温度以及料液比对紫杉烷类化合物得率的影响，通过正交实验确定最优提取工艺条件，拟为红豆杉资源的充分利用提供参考[8-9]。

1实验

1.1　材料、试剂与仪器

云南红豆杉树皮，杭州民泰中药饮片有限公司。

纤维素酶(活力大于30U·mg-1，进口分装)；10-DAB标准品(纯度大于95%)，红豆集团；无水乙醇(分析纯)，天津北联精细化学品开发有限公司；柠檬酸(分析纯)，天津凯通化学试剂有限公司；柠檬酸钠(分析纯)，天津风船化学试剂科技有限公司；石油醚(分析纯，沸程60~90 ℃)，天津百世化工有限公司。

752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；KQ-50E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；TDZ5-WS型离心机，长沙湘麓离心机仪器有限公司；中药材粉碎机，浙江瑞安春海药材机械厂。

1.2　方法

1.2.1标准曲线的绘制

精确称取10mg10-DAB，甲醇溶解并定容于100mL容量瓶，得浓度为0.1mg·mL-1的标准品溶液。分别准确吸取标准品溶液0.0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL于6个10mL容量瓶中，定容后，227nm下测定其吸光度。以吸光度(A)为纵坐标、浓度(c)为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为A=33.375c-0.0317，R2=0.9994。

1.2.2红豆杉树皮中紫杉烷类化合物得率的测定

取适量云南红豆杉树皮放入粉碎机中粉碎，过30目筛。以料液比1∶3(g∶mL)用石油醚浸泡粉末12h，除去脂类及部分脂溶性色素，然后于40 ℃下烘干除去溶剂，得云南红豆杉树皮粉末，阴凉处保存备用[10]。精密称取一定量的红豆杉树皮粉末和纤维素酶，加入一定量的pH=5的柠檬酸缓冲溶液，置于一定温度下保温一定时间后，5 000r·min-1离心5min，去上清液，加入无水乙醇20mL超声处理30min，5 000r·min-1离心5min，上清液用无水乙醇稀释一定倍数，吸取适量的提取液，按1.2.1方法测定吸光度。根据下式计算紫杉烷类化合物得率。

得率=[c×V×稀释倍数/m]×100%

式中：c为提取液中紫杉烷类化合物的浓度，mg·mL-1；V为提取液的体积，mL；m为样品的质量，g。

1.2.3单因素实验

1)酶处理时间对得率的影响

称取5份1.0g云南红豆杉树皮粉末，加入10mg纤维素酶和10mLpH=5的柠檬酸缓冲溶液，分别于40 ℃下保温0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，其它步骤同1.2.2。

2)酶处理温度对得率的影响

称取5份1.0g云南红豆杉树皮粉末，加入10mg纤维素酶和10mLpH=5的柠檬酸缓冲溶液，分别于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下保温1.0h，其它步骤同1.2.2。

3)酶用量对得率的影响

称取5份1.0 g云南红豆杉树皮粉末，分别加入0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的纤维素酶，再加入10 mL pH=5的柠檬酸缓冲溶液，40 ℃下保温1.0 h，其它步骤同1.2.2。

4)料液比对得率的影响

称取5份1.0 g云南红豆杉树皮粉末，加入10 mg纤维素酶，分别按料液比(g∶mL，下同)1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入pH=5的柠檬酸缓冲溶液，40 ℃下保温1.0 h，其它步骤同1.2.2。

1.2.4正交实验

根据单因素实验结果，以酶处理时间、酶用量、酶处理温度以及料液比为考察因素，以得率为考核指标，采用L9(34)正交实验优化提取工艺，正交实验的因素与水平见表1。

表1正交实验的因素与水平

Tab.1The factors and levels of orthogonal experiment

水平因素A.酶处理时间hB.酶用量%C.酶处理温度℃D.料液比g∶mL11.00.6351∶1221.50.8401∶1432.01.0451∶16

2结果与讨论

2.1　单因素实验结果与分析

2.1.1酶处理时间对得率的影响(图1)

图1　酶处理时间对得率的影响

由图1可知，当其它条件一定时，1.0 h是纤维素酶对云南红豆杉树皮粉末作用的最佳时间，超过1.0 h后，溶液中紫杉烷类化合物的得率开始呈下降趋势。这是因为，酶的作用具有高效性，在一定时间内，纤维素酶对紫杉烷类化合物的提取过程持续进行；但超过一定时间后，纤维素酶的活力随作用时间的延长逐渐减弱，导致提取作用减弱或停止。因此，确定最佳酶处理时间为1.0 h。

2.1.2酶处理温度对得率的影响(图2)

图2　酶处理温度对得率的影响

由图2可知，其它条件不变时，紫杉烷类化合物的得率随着酶处理温度的升高而逐渐上升，在酶处理温度为40 ℃时达到最高，超过40 ℃后逐渐下降。原因主要是温度对纤维素酶的活力有一定的影响，温度过低时酶的活力较低而不易达到最佳水平；温度过高则会导致酶活力降低或者失活，从而导致得率降低。因此，确定最佳酶处理温度为40 ℃。

2.1.3酶用量对得率的影响(图3)

图3　酶用量对得率的影响

由图3可以看出，在一定条件下，随着酶用量的增加，紫杉烷类化合物得率升高，在酶用量为0.8%时，紫杉烷类化合物得率最高；酶用量超过0.8%以后，紫杉烷类化合物得率下降。这是因为，酶用量偏低时，纤维素酶对底物提取作用不完全，导致紫杉烷类化合物的得率偏低；当酶用量过多时，酶对其它成分的提取作用也加强，导致提取液中的杂质增多，影响了酶对紫杉烷类化合物的提取作用。因此，确定最佳酶用量为0.8%。

2.1.4料液比对得率的影响(图4)

图4　料液比对得率的影响

由图4可知，一定条件下，随料液比的降低，纤维素酶的提取效果逐渐提高，紫杉烷类化合物的得率逐渐升高；在料液比达到1∶14时紫杉烷类化合物的得率最高，提取效果最好；当料液比继续降低时，紫杉烷类化合物的得率下降，提取效果下降。一般，料液比越小，即溶剂用量越大，提取物的得率越高，但是当溶剂用量达到一定值后，紫杉烷类化合物的提取已经基本完全，若继续加大溶剂用量，不仅会造成单位体积提取液中紫杉烷类化合物浓度的降低，提取液中溶出的其它成分也增多，而且还会造成溶剂和资源的浪费。因此，确定最佳料液比为1∶14。

2.2　正交实验结果与分析(表2)

表2正交实验结果与分析

Tab.2　Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可以看出，影响紫杉烷类化合物得率因素的大小顺序为D>B>A>C，即料液比>酶用量>酶处理时间>酶处理温度。最优提取工艺条件为A1B1C3D3，即酶处理时间1.0 h、酶用量0.6%、酶处理温度45 ℃、料液比1∶16。

2.3　验证实验

按A1B1C3D3工艺条件进行3组平行验证实验，结果表明，在最优工艺条件下，紫杉烷类化合物的平均得率为0.898%，3组验证实验的RSD=0.85%，表明此工艺条件重复性良好。

3结论

采用纤维素酶法处理红豆杉树皮，通过单因素实验和正交实验对酶法提取紫杉烷类化合物的工艺条件进行优化，得到最优工艺条件为：酶处理时间1.0 h、酶用量0.6%、酶处理温度45 ℃、料液比1∶16(g∶mL)。在最优工艺条件下，纤维素酶法提取云南红豆杉树皮中紫杉烷类化合物的得率可达0.898%。

使用无毒的无水乙醇为提取溶剂，不仅缩短了工艺时间，简化了工艺流程，还减少了有机溶剂的用量以降低对环境的污染。料液比对酶法提取红豆杉树皮中紫杉烷类化合物的影响相对较大，在工业生产中应严格控制料液比以保障紫杉烷类化合物的得率。纤维素酶法处理的工艺条件较温和、稳定，可为其工业化应用提供一定参考。

参考文献：

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[3]赵春芳,余龙江,刘智,等.中国红豆杉中主要紫杉烷类物质的分布研究[J].林产化学与工业,2005,25(1):89-93.

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Optimization on Extraction Process of Taxanes fromTaxusYunnanensis

XU Yun，SHA Xi-yang，WU Rui，HUANG Shi-xu，YANG Wen-ting

(CollegeofEnvironmentalandBiologicalEngineering，WuhanTechnology

andBussinessUniversity,Wuhan430065,China)

Abstract：The taxanes were extracted from bark of Taxus yunnanensis by cellulase method.Using enzyme treatment time,dosage of enzyme,enzyme treatment temperature,solid-liquid ratio as factors and the taxanes yield as an index,the extraction process was optimized by singal factor experiment and orthogonal experiment.Results showed that,the optimal extraction conditions were as follows:enzyme treatment time 1.0 h,dosage of enzyme 0.6%,enzyme treatment temperature 45 ℃ and solid-liquid ratio 1∶16(g∶mL).Under above conditions,the yield of taxanes was 0.898%.The extraction process was simple in operation and the extraction conditions were stable and mild.

Keywords：Taxus yunnanensis;cellulase;taxane;orthogonal experiment

中图分类号：O 629

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)01-0039-04

作者简介：徐芸(1994-)，女，湖北孝感人，研究方向：天然产物提取，E-mail：1924337061@qq.com；通讯作者：杨文婷，讲师，E-mail：47389578@qq.com。

收稿日期：2015-09-24

基金项目：武汉工商学院大学生科技创新项目(S201416)，武汉工商学院校级科研项目(A2014018)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.010