新藤黄酸对大鼠肝微粒体细胞色素P450亚型酶活性的影响
2016-03-01 05:37何瑞曦朱妍妍彭代银陈卫东
安徽中医药大学学报 2016年1期
陈 伟，何瑞曦，彭 慧，朱妍妍，彭代银，陈卫东
(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院，安徽 合肥 230012)
新藤黄酸对大鼠肝微粒体细胞色素P450亚型酶活性的影响
陈伟1,2，何瑞曦1,2，彭慧1,2，朱妍妍1,2，彭代银1,2，陈卫东1,2
(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；2.安徽省中医药科学院，安徽 合肥230012)
[摘要]目的采用“Cocktail”探针药物法考察新藤黄酸对大鼠肝微粒体细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)亚型酶活性的影响。方法将新藤黄酸与6种亚型酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4)对应的特异性混合探针药茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑与大鼠肝微粒体孵育，采用高效液相色谱法同时检测肝微粒体中6种探针底物的相对酶活性并计算其半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。结果不同浓度新藤黄酸作用后大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4酶活性相比较，差异均具有统计学意义，且随着新藤黄酸的浓度增高，各种酶的活性呈现明显的降低趋势。通过抑制曲线计算得到新藤黄酸对CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的IC50值分别为4.18、45.61、10.02 μmol/L，对CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1的IC50值均大于100 μmol/L。结论新藤黄酸对CYP2C19酶活性有中等抑制作用，对CYP3A4酶活性有弱抑制作用，但对CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1酶活性没有抑制作用。
[关键词]新藤黄酸；“Cocktail”探针药物法；大鼠肝微粒体；细胞色素P450
藤黄为藤黄科植物藤黄树(GarciniahanburyiHook. F.)的树干被割伤后的胶状树脂，中医主要用于攻毒、消肿、祛腐敛疮、止血、杀虫等，主治痈疽肿毒、溃疡、湿疮、肿瘤、顽癣、跌打损伤及烫伤等。藤黄中含藤黄酸、新藤黄酸和别藤黄酸等成分[1-2]。研究证实，新藤黄酸(结构式见图1)对多种肿瘤细胞，如肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞、结肠癌HCT116细胞均有不同程度的抑制作用[3-5]，而对正常细胞不敏感，且不影响脾、肾等器官的功能。
图1 新藤黄酸结构式
细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，参与了多数药物及内源性物质在体内的代谢[6-7]，其活性决定药物的代谢速率和清除率，而CYP450本身又可被药物诱导或抑制，导致与其联用的其他药物或者自身代谢的改变，从而产生代谢性药物相互作用，影响药效，产生不良反应[8]。其主要亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4参与市面上约90%以上药物代谢[9]。本实验旨在通过采用“Cocktail”探针药物法同时测定6种亚型酶底物的含量，评价新藤黄酸对大鼠肝微粒体CYP450不同亚型酶活性的影响，为新藤黄酸进一步的开发应用提供一定的依据。
1材料
1.1主要仪器岛津LC-15C型高效液相色谱仪：日本岛津公司；AB135-S十万分之一天平：METTLER TOLEDO公司；XW-80A微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；TG16-WS台式高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；WB-2000恒温水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；HaierDW-86L388A立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司。
1.2药品与试剂SD大鼠肝微粒体(20 mg/mL，置于-86 ℃冰箱中冷冻保存)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinncletiode, NADPH)再生系统(A液、B液，置于-86 ℃冰箱中冷冻保存)、100 mmol Tris-HCl(pH=7.4)缓冲液：均购于武汉普来特生物医药技术有限公司；茶碱(批号100121-201104)、双氯芬酸钠(批号 100334-200302)、奥美拉唑(批号 100367-201305)和氯唑沙宗(批号 100364-201302)均购自中国食品药品检定研究院；右美沙芬(批号 Y-104140421)和地西泮(批号 D-104140403)均购自于西安万昌生物科技有限公司；咪达唑仑(批号 D01-20140801)购自于天津一方科技有限公司，纯度均大于99%；新藤黄酸(纯度≥98%)：安徽中医药大学新藤黄酸课题组提供；乙腈、甲醇均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1溶液制备
2.1.1不同浓度新藤黄酸溶液的配制精密称取新藤黄酸，加二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶解，制备成摩尔浓度为20、8、4、2、1、0.25、0.062 5 mmol/L溶液。
2.1.2“Cocktail”探针药物溶液的配制精密称取茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑，加甲醇溶解，制备成质量浓度分别为0.180、0.636、0.345、0.680、0.542、0.390 g/L的“Cocktail”混合溶液。
2.1.3内标溶液的配制精密称取地西泮，加甲醇溶解，制成质量浓度为5 mg/L的内标溶液。
2.2孵育体系孵育反应体系总体积为500 μL。体系包括SD大鼠肝微粒体蛋白(0.4 mg/mL)，Tris-HCl缓冲液(100 mmol/L，pH值为7.4)，NADPH再生系统(A液、B液)以及6种混合探针底物(茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、氯唑沙宗、右美沙芬和咪达唑仑，终浓度分别为0.9、3.18、3.45、3.40、2.71、0.975 mg/L)，整个孵育体系中药物体积控制在1%以内。
2.3实验分组分为新藤黄酸组、空白组、无活性组。其中新藤黄酸组又按不同浓度分为7个组(终浓度分别为100、40、20、10、5、1.25、0.312 5 μmol/L)。空白组加入等容积DMSO，无活性组不加NADPH再生系统，以获得最大底物浓度。
2.4孵育方法向已加入10 μL SD大鼠肝微粒体(终浓度为0.4 mg/ mL)的Tris-HCl缓冲液中分别加入2.5 μL不同浓度的新藤黄酸受试溶液和2.5 μL含有6种探针底物的“Cocktail”混合溶液(操作过程均在冰浴上进行)。旋涡20 s混匀后置于37 ℃水浴中预孵化5 min，加入30 μL NADPH再生系统启动反应，37 ℃孵育30 min后，加入含有5 mg/L地西泮的甲醇溶液500 μL终止反应，旋涡振摇1 min，15 000 r/min离心10 min，取上清液，进样20 μL。每组平行做3份。
空白组加入等容积DMSO，无活性组不加NADPH再生系统，以获得最大底物浓度，其他操作同新藤黄酸组。按下式计算各CYP同工酶在不同药物作用下的相对酶活性。
用GraphPad Prism 5.0软件按非线性回归，将酶相对活性对新藤黄酸浓度的对数值作图，并计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。
2.56种探针底物的高效液相色谱条件Unitary C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以水(含0.1%乙酸)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序见表1；流速1.0 mL/min；检测波长为270 nm；柱温30 ℃。结果茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、氯唑沙宗、右美沙芬和咪达唑仑与内标物峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰，空白肝微粒体对测定无干扰，专属性强，见图2。
表1 流动相梯度洗脱程序
A. 6种混合探针药物及内标物的标准溶液；B. 空白肝微粒体加入6种探针药物和内标物；C. 空白肝微粒体；1. 右美沙芬；2. 茶碱；3. 咪达唑仑；4. 奥美拉唑；5. 地西泮(内标)；6. 氯唑沙宗；7. 双氯芬酸钠。
图2大鼠肝微粒体中6种探针药物及
内标的高效液相色谱图
2.6高效液相色谱法测定6种探针药物的方法学考察
2.6.1标准曲线的制备及线性范围采用倍半稀释法，将探针药物的储备溶液配制成一系列浓度的“Cocktail”混合溶液，茶碱的浓度分别为0.225、0.45、0.9、1.8、3.6、4.95、5.4 mg/L，双氯芬酸钠的浓度分别为0.795、1.59、3.18、6.36、12.72、17.49、19.08 mg/L，奥美拉唑的浓度分别为0.862 5、1.725、3.45、6.9、13.8、18.975、20.7 mg/L，右美沙芬的浓度分别为0.85、1.7、3.4、6.8、13.6、18.7、20.4 mg/L，氯唑沙宗的浓度分别为0.667 5、1.355、2.71、5.42、10.84、14.685、16.02 mg/L，咪达唑仑的浓度分别为0.243 8、0.487 5、0.975、1.95、3.9、5.362 5、5.85 mg/L。分别取大鼠肝微粒体10 μL加入500 μL Tris-HCl缓冲液(100 mmol/L，pH值为7.4)，经60 ℃加热使肝微粒体失活，冷却至室温后加入一系列不同浓度的“Cocktail”混合探针溶液2.5 μL，加入含有5 mg/L地西泮的甲醇溶液500 μL沉淀蛋白，旋涡振摇1 min，15 000 r/min离心10 min，取上清液，进样20 μL，记录色谱图。每组平行做3份。分别以茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑与内标峰面积比值(y)对各探针药物的浓度(x)进行线性回归，结果线性回归良好，回归系数均大于0.995，见表2。
表2 大鼠肝微粒体中6种探针底物的回归方程
2.6.2灵敏度按色谱峰信噪比(S/N)为3作为检测下限，茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑的最低检测限分别为0.05、0.05、0.03、0.05、0.05和0.08 mg/L。
2.6.3精密度与准确度分别取大鼠肝微粒体10 μL加入500 μL Tris-HCl缓冲液(100 mmol/L，pH值为7.4)，经60 ℃加热使肝微粒体失活，冷却至室温后加入低、中、高3种浓度的“Cocktail”混合溶液，每个浓度平行制备5份，同时做空白对照，按“2.6.1”项下操作处理样品，分别于同日内测定及连续5 d内测定5次，分别计算日内和日间精密度及准确度。结果见表3，所有样品的日内精密度和日间精密度小于10%，同时低、中、高3个浓度准确度在85%～115%范围内，符合生物样品分析要求。
2.6.4回收率试验分别取大鼠肝微粒体10 μL加入500 μL Tris-HCl缓冲液(100 mmol/L，pH值为7.4)，经60 ℃加热使肝微粒体失活，冷却至室温后加入低、中、高3种浓度的“Cocktail”混合溶液，各探针药物的3种浓度见表3。每个浓度平行制备5份，同时做空白对照，按“2.6.1”项下操作处理样品，进样分析得到峰面积，另取相应浓度的标准溶液直接进样，记录峰面积，按照公式“绝对回收率=100%×样品峰面积/对照品峰面积”计算其绝对回收率。将茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线方程计算出药物浓度，与理论浓度比较，计算方法回收率，其公式为“方法回收率=100%×药物浓度/理论浓度”。结果茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑的低、中、高浓度的绝对回收率和方法回收率均大于70%，且在待测浓度范围内，样品低、中、高浓度的回收率稳定(RSD<10%)，符合生物样品分析要求。
表3 肝微粒体样本中各探针药物的日内、
2.6.5稳定性分别取大鼠肝微粒体10 μL加入500 μL Tris-HCl缓冲液(100 mmol/L，pH值为7.4)，经60 ℃加热使肝微粒体失活，冷却至室温后加入低、中、高3种浓度的“Cocktail”混合溶液，各探针药物的3种浓度见表4。每个浓度平行制备5份。分别考察“室温放置6 h”“长期放置-20 ℃冰箱保存2周”“反复冻融3次”“样品处理后放置24 h”的稳定性。结果表明，在上述条件下样品均稳定。
3结果
新藤黄酸对大鼠肝微粒体CYP450亚型酶活性的影响见表4。不同浓度新藤黄酸作用后，大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4酶活性相比较，差异均具有统计学意义(CYP1A2：F(7,16)=124.29，P=0.000；CYP2C9：F(7,16)=31.23，P=0.000；CYP2C19：F(7,16)=49.55，P=0.000；CYP2D6：F(7,16)=126.43，P=0.000；CYP2E1：F(7,16)=30.09，P=0.000；CYP3A4：F(7,16)=222.56，P=0.000)。以酶相对活性为纵坐标，以新藤黄酸浓度的对数值为横坐标作图，可以得到新藤黄酸对CYP亚型酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4活性的抑制曲线，见图3。由图3可以直观地发现，随着新藤黄酸浓度的增高，各种酶的活性呈现明显的降低趋势。通过抑制曲线计算得到抑制50%酶活性的IC50值，见表5。结果新藤黄酸对CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的IC50值分别为4.18、45.61、10.02 μmol/L，对CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1的IC50值均大于100 μmol/L。
组别浓度/(μmol/L)CYP1A2CYP2C9CYP2C19CYP2D6CYP2E1CYP3A4空白043.17±0.44a33.27±0.93a51.50±0.35a49.17±2.62abcg17.63±1.81a56.27±0.15aGNA0.312533.70±0.15b25.60±0.64b37.30±0.93b51.27±0.23b23.30±0.56a52.10±0.35b1.2532.80±0.93b30.37±1.05a38.73±0.93b55.60±0.21cd22.10±0.59a50.80±1.13ab535.33±1.10b33.93±1.16ad25.27±0.33c49.63±0.24b24.40±0.85a54.17±1.08ab1035.03±1.42b37.73±1.57d18.60±0.36d52.03±0.48bd26.20±0.79a26.30±1.06c2023.90±0.85c25.00±2.35bc10.00±3.70bcd31.70±0.50eg20.23±0.97a17.23±1.12d4020.00±1.27d13.90±1.64e11.93±4.08abcd17.40±1.57f13.63±2.38ab12.80±2.57cd1003.43±1.79e34.80±0.78ad15.67±1.85cd10.17±3.09ef3.50±1.60b17.43±1.23cd
注：GNA表示新藤黄酸；具有相同右上标字母的组别相比较，P>0.05；不具有相同右上标字母的组别相比较，P<0.05。
图3 新藤黄酸对CYP各亚型酶活性的抑制曲线图
CYP亚型酶特异性探针底物IC50值/(μmol/L)CYP1A2茶碱>100CYP2C9双氯芬酸钠>100CYP2C19奥美拉唑4.180CYP2D6右美沙芬45.61CYP2E1氯唑沙宗>100CYP3A4咪达唑仑10.02
4讨论
本实验选择了CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4六种亚型酶以及各酶对应的探针底物茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑，采用高效液相色谱法测定肝微粒体孵育样本中底物的浓度，此法能够保证肝微粒体样本中底物浓度测定的准确性。通过对6种探针底物进行全波长扫描发现各探针底物的最大紫外吸收波长都在270 nm附近，最终将270 nm定为紫外检测波长。考虑到需要分离的物质是具有不同化学结构及理化性质的多成分(6种探针底物和内标物)，本实验选用了0.1%乙酸为水相、乙腈为有机相进行梯度洗脱。
大鼠肝微粒体体外代谢实验的关键是酶活性的保持，因此，课题组参考相关文献将肝微粒体提前分装，放置于-86 ℃冰箱中保存，以防反复冻融降低肝微粒体CYP450的酶活性[10]。同时加样操作在冰浴上进行，孵育反应的温度选择37 ℃，有氧环境下进行孵育，以保持酶活性，维持正常反应。孵育反应结束选择冰甲醇作为终止试剂，无内源性干扰，且终止效果较好。根据美国相关指导原则[11]，肝微粒体体外孵育体系中加样容积不超过1%，肝微粒体蛋白浓度、孵育时间和NADPH对孵育反应都有影响，经过考察本实验选择的肝微粒体蛋白浓度、孵育时间和NADPH加入量满足实验所需，能使反应有效地进行。
本研究在体外以“Cocktail”探针药物法结合大鼠肝微粒体孵育体系评价新藤黄酸对大鼠肝微粒体CYP450酶活性的影响，通过测定酶活性获得抑制曲线和IC50。根据通用的CYP450酶抑制剂强度分级规则[12]可知：若IC50<1 μmol/L表示抑制作用很强，容易抑制药物代谢酶引发药物相互作用；若1 μmol/L
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Effects of Gambogenic Acid on Activities of Cytochrome P450 Enzymes in Rat Liver Microsomes
CHENWei1,2,HERui-xi1,2,PENGHui1,2,ZHUYan-yan1,2,PENGDai-yin1,2,CHENWei-dong1,2(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)
[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of gambogenic acid on the activities of cytochrome P450 (CYP450) enzymes in rat liver microsomes by a probe-drug cocktail. MethodsThe rat liver microsomes were incubated with gambogenic acid and the mixture of specific probe drugs (theophylline, diclofenac sodium, omeprazole, dextromethorphan, chlorzoxazone, and midazolam) for the six CYP450 enzymes (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, and CYP3A4). High-performance liquid chromatography was applied to measure the relative enzymatic activities of six probe substrates in liver microsomes and calculate half maximal inhibitory concentration (IC50). ResultsAfter incubation with gambogenic acid at various concentrations, there were significant differences in the activities of CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, and CYP3A4 in rat liver microsomes, and with the increasing concentration of gambogenic acid, the activities of these enzymes decreased significantly. According to the inhibitory curve, the IC50of gambogenic acid for CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4 was 4.180, 45.61, and 10.02 μmol/L, respectively, and the IC50of gambogenic acid for CYP1A2, CYP2C9, and CYP2E1 was higher than 100 μmol/L. ConclusionGambogenic acid has a moderate inhibitory effect on the activity of CYP2C19 and a weak inhibitory effect on the activity of CYP3A4, but shows no inhibitory effects on CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6, and CYP2E1.
[Key words]Gambogenic acid; Probe-drug cocktail; Rat liver microsome; Cytochrome P450
收稿日期：(2015-09-15；编辑：张倩)
通信作者：陈卫东，anzhongdong@126.com
作者简介：陈伟(1989-)，女，硕士研究生
基金项目：国家重大新药创制项目(009ZX09103-399)；安徽省科技攻关计划项目(1301042099)；安徽省高校省级自然科学研究重点项目(KJ2011A190)
[中图分类号]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.01.023
