虾青素缓解Tau蛋白过度磷酸化减轻视神经放射性损伤的分子生物学机制探讨

陈利明，任春吾，刘旭阳，杨仕庆

(1.深圳市龙岗区第五人民医院眼科，广东深圳518111；2.深圳市眼科医院青光眼专科科室，广东深圳518000)

虾青素缓解Tau蛋白过度磷酸化减轻视神经放射性损伤的分子生物学机制探讨

陈利明1，任春吾1，刘旭阳2，杨仕庆1

(1.深圳市龙岗区第五人民医院眼科，广东深圳518111；2.深圳市眼科医院青光眼专科科室，广东深圳518000)

目的分析视神经放射性损伤的分子生物学机制及虾青素对Tau蛋白过度磷酸化减轻效果。方法选取64例离体培养鼠视网膜神经节细胞株RGC-5培养的神经元，30 Gy γ射线电离辐射，随机选择64个细胞培养小室，根据有无虾青素滴加分为虾青素标准品组及无虾青素标准品组各32个，观察两组照射后12 h、24 h、48 h、1周后Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白、PP-2A蛋白表达差异。结果同组不同时间比较可见虾青素标准品组照射后随时间增长，Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白有所下降，PP-2A蛋白表达有所上升，这种变化在无虾青素标准品组表现不明显(P＞0.05)，同时间组间比较照射后不同时间虾青素标准品组Tau蛋白激酶、GSK-3β蛋白表达低于无虾青素标准品组，而PP-2A蛋白表达高于无虾青素标准品组，数据经统计学处理，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论虾青素能够有效降低GSK-3β蛋白的表达及提高PP-2A蛋白表达，降低γ射线电离辐射致Tau蛋白过度磷酸化，从而可能对抑制Tau蛋白过度磷酸化而预防电离辐射对视神经的损伤。

视神经；放射性损伤；虾青素；Tau蛋白；GSK-3β蛋白；PP-2A蛋白

γ刀放射外科治疗目前在临床各类颅脑疾病的治疗中应用较为广泛，其临床治疗效果较为显著[1]，但是在γ刀放射治疗中，放射性视神经病变的发病率不断提高，引起了临床的重点关注和研究[2]。目前对于γ射线电离辐射致视神经损伤的发生机制未明确，但神经受照剂量和受照容积对视神经的损伤程度影响已得到广泛认同[3]。本文观察了γ射线电离辐射致Tau蛋白过度磷酸化及虾青素对其缓解的影响，分析了视神经放射性损伤的分子生物学机制，对γ射线电离辐射导致视神经放射性损伤的预防及治疗提供思路，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 模型建立与分组方法离体培养鼠视网膜神经节细胞株RGC-5培养的神经元由上海斯信生物科技有限公司提供，照射条件为瑞典医科达公司Leksell C型γ刀，照射剂量为30 Gy，将种植有离体培养的大鼠视网膜神经节细胞小室固定于立体定位框架，培养皿中心点与定位框架中心点(坐标：x=100，y=100，z=100)位置重合，γ角90°，8 mm准直器，按相应治疗剂量分组进行照射。随机选择64个细胞培养小室，按数字法随机选取32个细胞培养小室为虾青素标准品组，给予虾青素标准品(3 mg/10 μl)滴加入视神经节细胞，余32个细胞培养小室未处置为未虾青素标准品组。

1.2 免疫组化检测方法将选取的细胞培养小室利用非生物素两步法行免疫组化学检测：常规给予石蜡包埋处理，连续切片5µm，多聚赖氨酸防脱处理后常规给予脱腊后预处理，3%H2O2孵育磷酸缓冲液(PBS)冲洗2 min，连续3次，分别滴加1：400稀释一抗Tau蛋白激酶抗体、1：400稀释GSK-3β抗体、1：400稀释PP-2A抗体，PBS冲洗2 min，连续3次，滴如二抗，室温孵育30 min后给予PBS溶液冲洗2 min，连续3次，显微镜下观察DBA显色并控制反应的时间，吸掉多余显色液后蒸馏水冲洗，复染、脱水、透明、封片。图像分析采用15×40倍的光镜视野，Dpx View Pro型显微彩色图像处理系统进行图象采集与分析，Image-Pro Plus 6.0图像处理软件统计阳性表达累计光密度值(IOD)，每张切片选3个连续的不同视野，最终结果取平均值。

1.3 观察指标分别在两组照射后12 h、24 h、48 h、1周随机选取每组8个细胞培养小室，对视网膜神经节细胞中Tau蛋白激酶表达阳性糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、蛋白质磷酸酶-2A(PP-2A)表达情况进行检测，比较两组差异。

1.4 统计学方法应用SPSS17.0统计分析软件包进行数据分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示，两两比较采用t检验，多组数据比较采用LSD或Dunnett's C检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tau蛋白激酶表达情况比较电离辐射后两组大鼠神经节RGC-5离体培养神经元Tau蛋白激酶表达比较见表1。由此可见，随着照射后时间增加，虾青素标准品组Tau IOD值有所下降(P＜0.05)，而无虾青素标准品组未见明显下降(P＞0.05)，同时间两组Tau IOD值比较虾青素标准品组低于无虾青素标准品组，数据经统计学处理，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 两组照射后不同时间Tau蛋白激酶表达Tau IOD值比较(±s)

表1 两组照射后不同时间Tau蛋白激酶表达Tau IOD值比较(±s)

组别12 h 24 h 48 h 1周虾青素标准品组无虾青素标准品组t值P值201.4±11.8 241.7±20.7 4.153＜0.05 183.6±10.6 236.6±18.6 5.681＜0.05 165.8±11.5 228.4±18.9 6.951＜0.05 148.1±7.2 229.5±19.8 9.525＜0.05

2.2 GSK-3β表达情况比较电离辐射后两组大鼠神经节RGC-5离体培养神经元GSK-3β表达比较见表2。由此可见，随着照射后时间增加，虾青素标准品组GSK-3β表达有所下降(P＜0.05)，而无虾青素标准品组未见明显下降(P＞0.05)，同时间两组GSK-3 β表达比较虾青素标准品组低于无虾青素标准品组，数据经统计学处理，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

组别虾青素标准品组无虾青素标准品组t值P值12 h 5.73±0.24 5.95±0.29 4.682＜0.05 24 h 5.44±0.21 5.81±0.24 5.018＜0.05 48 h 5.31±0.18 5.84±0.27 5.618＜0.05 1周5.23±0.15 5.87±0.26 6.652＜0.05

2.3 PP-2A表达情况比较电离辐射后两组大鼠神经节RGC-5离体培养神经元PP-2A表达比较见表3。由此可见，随着照射后时间增加，虾青素标准品组PP-2A表达有所上升(P＜0.05)，而无虾青素标准品组未见明显上升(P＞0.05)，同时间两组PP-2A表达比较虾青素标准品组高于无虾青素标准品组，数据经统计学处理，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 两组照射后不同时间PP-2A表达比较(±s)

表3 两组照射后不同时间PP-2A表达比较(±s)

组别12 h 24 h 48 h 1周虾青素标准品组无虾青素标准品组t值P值12.8±1.8 11.4±2.2 3.845＜0.05 15.0±2.1 11.8±2.4 4.158＜0.05 16.1±2.3 11.6±2.1 4.625＜0.05 17.6±2.3 11.9±2.3 5.755＜0.05

3 讨论

电离辐射能使机体内的水分子分解产生活性氧自由基(ROS)如超氧阴离子自由基、过氧化氢自由基、羟自由基等[4]，可引发机体氧化应激反应(OS)，这些活性氧能引起细胞、组织和血管的损伤[5]。Tau蛋白属低分子微管相关蛋白，集中分布在树突和轴突，呈现一种高度不对称磷蛋白，在微管组装的早期，Tau蛋白结合是核心，其能够促进轴突的微管装配与稳定，并可保持微管之间距离的稳定，同时对神经细胞的轴突物质运输有其影响，刺激并提高神经元的生长发育，对脂质的过氧化进行抑制，减少微管蛋白的聚集[6]。这种微管的结合能力依靠丝氨酸与苏氨酸的磷酸化指导进行调节，为神经元功能调节主要手段，如果出现异常的磷酸化，错误折叠与分子聚集可能会导致稳定微管功能的削弱，从而导致递质运输、储存以及释放功能的障碍[7]。

有研究表明Tau蛋白的过度磷酸化是以氧化应激为前端的[8]，在此之后Tau蛋白会出现错误的折叠以及高度磷酸化聚集，而Tau蛋白的异常化也能够对线粒体功能进行干预，从而加剧氧化应激或产生其他逆行性事件的加剧，由此可见，Tau蛋白的过度磷酸化和氧化应激存在一定程度的相互促进从而导致恶性循环的发生。Tau蛋白的过度磷酸化表达蛋白之中，GSK-3β的作用较为显著，现代研究表明其为丝氨酸-苏氨酸的蛋白激酶，在Tau蛋白激酶中影响最大，可多位点磷酸化Tau蛋白，而其中GSK-3β 1H8是其最主要的活性形式[9]；PP-2A为丝氨酸、苏氨酸的蛋白磷酸酶，现代研究表明它对细胞的增殖、生长、分化、凋亡过程影响较大，是活性最强的p-tau磷酸酯酶，可催化Tau蛋白多个位点去磷酸化，使磷酸化Tau蛋白恢复生物学功能。

虾青素隶属于类胡萝卜素，现代研究表明其有着脂质过氧化的抑制作用，同时能够有效的清除体内自由基，有着延缓衰老、抗癌等作用，其动物试验表明可通过对视神经中Glu浓度的下调，有效的抑制GSK-3β 1H8表达，从而进一步减缓Tau蛋白过磷酸化的程度[10]。有人认为虾青素抗氧化性具有保护神经的作用，特别是对缺血小鼠的神经具有明显的保护作用。而有人对H2O2损伤的HepG2细胞的大鼠模型进行虾青素干预后采用MTT法测定LDH的含量表明，虾青素能够有效的提高细胞生存率，对细胞毒性损伤的保护作用良好，同时通过对细胞Ca2+浓度的测定表明虾青素能够有效的降低细胞中Ca2+的浓度，从而对神经细胞和线粒体氧化损伤起到显著保护作用。这些研究都表明虾青素对细胞及神经氧化损伤方面有着较好的抗氧化活性效果。本文结果显示，经电离辐射后的各时间段，滴加虾青素标准品的大鼠神经节RGC-5离体培养神经元Tau蛋白激酶IOD值低于未添加虾青素组别，且滴加虾青素后，Tau蛋白激酶IOD值会随时间而下降，这表明虾青素对经电离辐射导致的小鼠视神经细胞独行作用起到了一定的逆转效果，其影响GSK-3β、PP2A的表达，有效的减缓了Tau蛋白的过磷酸化程度，从而对视神经功能的恢复起到一定的效果。

综上所述，本文通过γ射线电离辐射致Tau蛋白过度磷酸化及虾青素对其的缓解情况进行分析，对Tau蛋白过度磷酸化及其调控蛋白的表达分析可见，虾青素能够有效的降低GSK-3β蛋白的表达及提高PP-2A蛋白表达，降低γ射线电离辐射致Tau蛋白过度磷酸化情况，从而可能对抑制Tau蛋白过度磷酸化而预防电离辐射对视神经的损伤。

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Molecular biological mechanisms of astaxanthin in alleviating Tau hyperphosphorylation and reducing opticnerve radiation damage.

CHEN Li-ming1,REN Chun-wu1,LIU Xu-yang2,YANG Shi-qing1.1.Department of Ophthalmology,the Fifth People's Hospital of Longgang District of Shenzhen,Shenzhen 518111,Guangdong,CHINA;2. Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Ophthalmologic Hospital,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo analyze the molecular biological mechanisms of optic nerve radiation damage and the effect of astaxanthin in alleviating Tau hyperphosphorylation.MethodsSixty-four cases of cultured neurons from in vitro cultured rat retinal ganglion cell line RGC-5 underwent γ-ray ionizing radiation(30 Gy).Then 64 cell culture chambers were randomly selected and divided into astaxanthin group(n=32)and non-astaxanthin group(n=32)based on the presence or absence of astaxanthin.12 h,24 h,48 h,1 week after irradiation,the expression of Tau protein kinase, GSK-3β protein,PP-2A protein were observed and compared between the two groups.ResultsIn astaxanthin group, the expression of Tau protein kinase,GSK-3β protein showed a decreasing trend 12 h,24 h,48 h,1 week after irradiation,while the expression of PP-2A showed an increasing trend.This change was not significant in non-astaxanthin group(P＞0.05).At the same time point,the expression of Tau protein kinase,GSK-3β protein were significantly lower in astaxanthin group than non-astaxanthin group,while the expression of PP-2Aprotein was significantly higher in astax-anthin group than non-astaxanthin group(P＜0.05).ConclusionAstaxanthin can effectively reduce the expression of GSK-3β protein and increase the expression of PP-2A protein,alleviate Tau hyperphosphorylation induced by γ-ray ionizing radiation,and hence reduce the optic nerve radiation damage by inhibiting the overexpression of Tau protein.

Optic nerve;Radiation damage;Astaxanthin;Tau protein;GSK-3β protein;PP-2Aprotein

R774.6

A

1003—6350（2016）01—0013—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.005

2015-09-02)

广东省深圳市龙岗区2014年度科技计划资助项目(编号：YLWS20140610105809149)

刘旭阳。E-mail：1148668608@qq.com