程序性细胞死亡4 mRNA在结直肠癌组织中的表达及意义*

李日恒，李爽，宋艳敏，张爱民，刘渤，胡光（.河北大学附属医院普外科，河北保定07000；.内蒙古兴安盟人民医院输血科，内蒙古乌兰浩特37400）



程序性细胞死亡4 mRNA在结直肠癌组织中的表达及意义*

李日恒1，李爽2，宋艳敏1，张爱民1，刘渤1，胡光1
（1.河北大学附属医院普外科，河北保定071000；2.内蒙古兴安盟人民医院输血科，内蒙古乌兰浩特137400）

摘要：目的研究腹腔镜结直肠癌根治术癌组织中程序性细胞死亡4（PDCD4）mRNA的表达，以及与结直肠癌临床资料的相关性。方法收集2012～2014年腹腔镜手术结直肠癌及癌旁正常组织标本54例，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测结直肠标本中PDCD4 mRNA水平；分析PDCD4 mRNA水平与临床资料的相关性。结果①结直肠癌组织中PDCD4表达降低甚至不表达，表达降低率为64.8%（35/54），△Ct值为（4.50±0.60）；正常组织中PDCD4高表达，△Ct值为（3.54±0.52），差异有统计学意义（P＜0.05）。②结直肠癌组织中PDCD4 mRNA水平与分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关，与性别、年龄、肿瘤部位无关；分化程度越低，有淋巴结转移，浸润越深，则PDCD4 mRNA表达更低。结论结直肠癌中PDCD4 mRNA表达下降，PDCD4 mRNA水平与性别、年龄、肿瘤部位无关，与分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关。

关键词：腹腔镜；结直肠癌；程序性细胞死亡4

Expression of PDCD4 mRNA in human colorectal cancer and its significance*

Ri-heng Li1, Shuang Li2, Yan-min Song1, Ai-min Zhang1, Bo Liu1, Guang Hu1
(1. Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding, Hebei 071000, China; 2. Department of Blood Transfusion, Xingˊanmeng Peopleˊs Hospital, Ulanhot, Inner Mongolia 137400, China)

Abastract: Objective To study programmed cell death 4 (PDCD4) mRNA expression in colorectal cancer tissues from laparoscopic radical resection, as well as its relationship with the clinical data of colorectal cancer. Methods Specimens of colorectal cancer tissues and normal tissues adjacent to carcinoma from 54 cases were collected in laparoscopic surgery between 2012 and 2014. PDCD4 mRNA level was detected by RT-PCR in colorectal cancer specimens. The relationship between PDCD4 mRNA level and clinical data was analyzed. Results PDCD4 expression in the colorectal cancer tissues reduced or even was not seen, the rate of lowered PDCD4 expression was 64.8%(35/54) with△Ct (4.50±0.60); the normal tissues had high expression of PDCD4 with△Ct (3.54±0.52), the difference was statistically significant (P＜0.05). The PDCD4 mRNA level in the colorectal cancer tissues was correlated with the differentiation degree, lymph node metastasis and tumor infiltration depth, but not correlated with gender, age or tumor location. PDCD4 mRNA expression was lower in patients with lymph node metastases than those without ymph node metastasis. The lower the degree of differentiation and the deeper infiltration, the lower the PDCD4 mRNA expression. Conclusions PDCD4 mRNA expression lowers in colorectal cancers. PDCD4 mRNA level is not correlated with gender, age or tumor location, but correlated with degree of differentiation, lymph node metastasis and tumor infiltration depth.

Keywords:laparoscope; colorectal cancer; programmed cell death 4

结直肠癌的发生是多因素、多步骤共同作用的结果，癌基因与抑癌基因表达失衡发挥重要作用。随着分子水平的发展，结直肠癌发病机制的研究有很大进展，为结直肠癌的诊断和治疗提供更为确切的理论依据[1]。腹腔镜结直肠癌根治术已经作为一种常规手术方式应用于临床[2-3]。

程序性细胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4），是与细胞凋亡相关的抑癌基因，PDCD4参与细胞的转录、翻译及多种信号通路，来发挥抑制肿瘤生长的作用[4-6]。已经证实PDCD4在结直肠癌、肝癌、肺癌、脑胶质瘤等多种肿瘤组织中表达降低，PDCD4表达水平与多种肿瘤患者的预后有关，高表达的PDCD4还能增加化疗药物的敏感性，本文目的是探讨结直肠癌组织中PDCD4转录水平的表达，以及与结直肠癌临床资料的相关性。

1　资料与方法

1.1病例资料

选取2012～2014年在河北大学附属医院普通外科行腹腔镜结直肠癌根治术的患者54例，取其结直肠癌及癌旁正常组织标本。纳入标准：患者术前未接受放射、化学及免疫治疗，未发生远处转移。收集癌组织时，除已发生坏死的肿瘤组织外，取距癌组织边缘＞10 cm的癌旁正常组织，取全层，诊断结果由术后病理检查确定。其中男性32例，女性22例；年龄36～82岁，平均59.69岁；直肠癌19例，结肠癌35例。

1.2保存方法

腹腔镜结直肠癌根治术中即刻取标本置于液氮中，-80℃冰箱内保存时间≤6个月，手术操作过程严格按照直肠系膜全切除（total mesoreetal exeision，TME）原则进行操作。

1.3试剂与仪器

1.3.1主要试剂Omega E.Z.N.A.TM总RNA提取试剂盒、Vazyme Hiscript第一链cDNA合成试剂盒、Vazyme Hiscript qRT PCR荧光定量试剂盒、去RNA酶的EP管、枪头、8联排、β-actin和PDCD4引物由石家庄市惠友生物科技有限公司提供，β-actin引物、PDCD4普通引物根据Primer Premier 5.0软件设计，并通过Pubmed Blast检测其特异性，由上海生工生物工程股份有限公司合成。实验中RNA提取及核酸电泳过程中所需的氯仿、无水乙醇、75%无水乙醇、5×loading buffer、gelred染液、琼脂糖、1×TAE液、DNA Marker等由河北大学附属医院中心实验室提供。

1.3.2主要仪器高速冷冻离心机（Thermo Sorvall ST16R型，德国Thermo Electron LED GmbH Am Kalkberg公司），微量高速冷冻离心机（FRESC021型，德国Thermo Fisher Scientific公司），全波长酶标仪（EPOCH型，美国基因有限公司），全自动凝胶成像仪（Champ Gel 5000型，北京赛智创业科技有限公司），普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪器（Veriti型，美国Applied Biosystems公司），实时荧光定量PCR仪（7300型，美国Applied Biosystems公司），涡旋振荡器（Vortex-5型，美国其林贝尔仪器制造有限公司），全自动雪花制冰机（IMS-200型，北京德天佑科技发展有限公司）。

1.4方法

1.4.1组织总RNA的提取取约30 mg组织，根据Omega E.Z.N.A.TM总RNA试剂盒说明书提取总RNA，取产物2μl于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外线下观察并记录结果。以显示3条条带且条带清晰为RNA无明显降解。同时在酶标仪检测含量（2 000 ng/μl）及比值（A260/A280光度值：1.9～2.0）合适后进行逆转录，中途不能及时完成时将产物放置入-20℃或-80℃冰箱冷冻保存，保存时间≤3个月。

1.4.2逆转录根据酶标仪结果调整RNA含量，根据Vazyme Hiscript第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录，体系为Oligo dT 1μl，总RNA 1μg，RNase free ddH2O 6μl混合反应物，65℃预热10min，冰上骤冷2min。随后加入2×RT Mix 10μl，Hiscript Enzyme Mix 2μl，在25℃预变性5 min、42℃变性30 min、85℃退火5 min的反应条件下进行处理，反应结束后产物模板cDNA进行分装稀释，放置于-20℃冰箱内，保存时间≤6个月，待行PCR反应。

1.4.3逆转录-聚合酶链反应通过Primer Premier 5.0进行引物设计，NCBI Blast进行引物特异性检测。PDCD4正向引物：5´-TGGGAGTGACGCCCTTAG A-3´，反向引物：5´-TCCACCTCCTCCACATCATACA-3´，产物长度171 bp；内参基因β-actin正向引物：5´-GTGGACATCCGCAAAGAC-3´，反向引物：5´-AA AGGGTGTAACGCAACTAA-3´，产物长度302 bp。逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反应体系20μl：模板cDNA 2μl，Mix 10μl，Rox 2μl，正、反向引物2μl，灭菌蒸馏水4μl。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火32 s，共40个循环；95℃预变性15 s，60℃变性60 s，95℃退火15 s。扩增后的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪上分析并记录图像结果。

1.5统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，计数资料以率表示，并行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1结直肠癌组织中PDCD4 mRNA的表达

PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果显示，actin 302 bp，PDCD4 171 bp，癌组织中PDCD4表达降低甚至不表达，表达降低率为64.8%（35/54），△Ct值为（4.50±0.60），正常组织中高表达△Ct值为（3.54± 0.52），差异有统计学意义（P=0.036）。△Ct值越高，表明相对扩增数多，相对表达量越低。见图1～3。

2.2PDCD4 mRNA水平与结直肠癌临床特征的相关性

结直肠癌组织中PDCD4 mRNA水平与性别、年龄、肿瘤部位无关，与分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关。分化程度越低、淋巴结转移、浸润越深，则PDCD4 mRNA表达越低。见附表。

图1　PDCD4 mRNA扩增曲线

图2　PDCD4 mRNA凝胶电泳结果

图3　PDCD4 mRNA的表达

附表　临床特征与结直肠癌组织中PDCD4 mRNA水平的相关性

3　讨论

结直肠癌的发病率和死亡率日趋上升，严重危害人类的生命健康。手术切除仍是治疗结直肠癌的主要手段。在完全坚持TME原则的前提下，与传统开腹手术比较，腹腔镜结直肠癌根治术具有切口小、患者痛苦少、恢复快等优点。

人类PDCD4首先从胶质瘤细胞中分离出来，其蛋白主要由N端、C端及两个保守的α-helical MA-3区域组成，2个MA-3对于绑定eIF4A和RNA移位是必不可缺的。MA-3区域与eIF4GI、eIF4GII有关的ATP依赖的RNA解螺旋酶eIF4A蛋白的相互作用有关。PDCD4的氨基酸序列中也包含多个磷酸化位点，PDCD4调节转录的过程可能更为复杂[7]。

PDCD4在不同组织中的作用机制不同。易波等[8]研究显示，PDCD4可能通过上调死亡相关蛋白5表达来诱导大肠癌细胞的凋亡。PDCD4还能在一定程度上抑制细胞浸润转移，PDCD4-siRNA敲除的结直肠癌HT-29细胞能明显促进结直肠癌细胞的分化，且能明显提高c-Jun磷酸化以及eIF4E、Fas相关性死亡结构域蛋白样白细胞介素转变酶抑制蛋白的表达；AKt/Pr激酶B可促使PDCD4的Ser67、Ser457位点发生磷酸化，引起PDCD4发生核转录，使活化剂蛋白1（activator protein 1，AP1）调控的转录功能下降，同时影响肿瘤转移[9]。Yang[10]和Wang等[11]证实PDCD4蛋白能抑制人类结肠RKO细胞中c-Jun的激活，引起抑制转录蛋白AP1的失活，抑制细胞的恶性转化及血管形成。在结直肠癌细胞HT-29中，PDCD4缺失，刺激AP1依赖的转录，诱导c-Jun蛋白表达水平的升高。PDCD4能抑制JNK的活性，从而抑制c-Jun的磷酸化，阻止eIF4E的磷酸化，使金属蛋白酶MMP-9和MMP-2表达降低，抑制细胞转移；逆转其磷酸化反应后，金属蛋白酶MMP-9和MMP-2表达增加，促进细胞转移[12]。

Zhen等[13]在研究鼻咽癌细胞时证实PDCD4在8种鼻咽癌细胞株中表达降低，其表达下降与进展和不良预后成正相关，同时与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期密切相关；随着分期的增高，PDCD4表达下降的趋势越明显。不论TNM分期如何，PDCD4的高水平表达能显著改善患者预后。例如在早期肺癌组织中，与正常组织相比，PDCD4 mRNA和PDCD4蛋白的表达水平明显降低，PDCD4的表达水平与年龄、性别及有无远处转移无明显相关，但与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期及预后相关，差异有统计学意义。PDCD4达水平降低的程度越大，肿瘤恶性程度越高，但在非小细胞癌中，PDCD4表达水平与临床参数无相关。而给K-ras缺失的裸鼠吸入气溶胶PDCD4能显著抑制细胞增殖和肿瘤进展过程，并促进凋亡[14]。本研究收集腹腔镜结直肠癌根治术组织标本，对标本进行检测，分析PDCD4 mRNA水平与结直肠癌的相关性。结果显示，结直肠癌组织中PDCD4 mRNA水平降低，说明转录水平调节受影响，结直肠癌组织中PDCD4 mRNA水平与性别、年龄、肿瘤部位无关，与分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关。分化程度越低、淋巴结转移、浸润越深，则PDCD4 mRNA表达越低。这与鼻咽癌和早期肺癌的研究结果相似，却与非小细胞癌的研究结果不一致。考虑为PDCD4在不同的组织中表达量不同，发挥的机制不同，导致这种组织上的差异。薛迪新等[15]证实结直肠癌中PDCD4蛋白的表达与肿瘤浸润深度、无淋巴结转移和临床分期有关，而与年龄、部位、肿瘤大小及有无远处转移无关，PDCD4蛋白表达水平下调提示结直肠癌预后不良，大肠癌组织中PDCD4蛋白表达缺失可促进结直肠癌细胞增殖。与转录前比较，转录后恢复PDCD4蛋白的表达水平能更好地治疗大肠癌。

有学者提出恢复转录后PDCD4蛋白水平比恢复转录前水平对治疗结直肠癌更为重要。蛋白发挥功能必须通过基因转录、翻译的过程，如果转录抑制，翻译就无法进行，因此了解PDCD4在结肠癌组织中的转录水平才能为重新表达提供依据。PDCD4转录水平的异常调控影响结直肠癌的发生、发展，这为结直肠癌的诊断和治疗提供依据。

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（申海菊编辑）

*基金项目：河北省科技计划项目（No：132777248）

收稿日期：2015-05-04

文章编号：1005-8982（2016）03-0018-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.004

中图分类号：R735.3

文献标识码：A