晚期非小细胞肺癌中上皮细胞间质转型和表皮生长因子受体的检测及其相关性研究

柴春香，王晓敏，郭文君，孙永红（潍坊医学院附属医院.医务科，.病理科，山东潍坊6000）



晚期非小细胞肺癌中上皮细胞间质转型和表皮生长因子受体的检测及其相关性研究

柴春香1，王晓敏2，郭文君2，孙永红2
（潍坊医学院附属医院1.医务科，2.病理科，山东潍坊261000）

摘要：目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）中上皮细胞间质转型（EMT）与表皮生长因子受体（EGFR）的相关性。方法免疫组织化学法（EnVision）检测78例晚期NSCLC组织和16例正常肺组织中的EGFR、E-钙黏素（E-cadherin）和波蛋白（Vimentin）的表达。EGFR 18～21号外显子聚合酶链反应（PCR）扩增及基因测序。结果78例NSCLC中，EGFR、E-cadherin和Vimentin在NSCLC中阳性表达率分别为61.5%（48/78）、43.6% （34/78）和56.4%（44/78），EGFR基因突变率为24.4%（19/78），正常组为阴性。EGFR野生型组的EMT发生率高（67.8% vs 21.1%），EGFR蛋白与EMT呈正相关性（r=0.236，P=0.037）。结论E-cadherin降低或全部丢失及EGFR通过信号传导通路可以促进EMT的发生。

关键词：晚期非小细胞肺癌；上皮细胞间质转型；表皮生长因子受体

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是目前较常见的肿瘤相关死亡原因，晚期NSCLC患者发生淋巴结或远处转移，治疗效果及预后较差。肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤转移主要因素之一，研究表明，上皮细胞间质转型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤细胞侵袭过程中起重要作用，EMT的发生与多种蛋白分子和信号传导通路有关，以E-钙黏素（E-cadherin）表征上皮型指标蛋白的丧失以及波蛋白（Vimentin）表征间质型指标蛋白的获得为主要特征。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）介导的信号传导通路在NSCLC的研究中较热门，尤其是基因检测及靶向治疗中的应用价值被广泛认可。本实验对78例发生转移的晚期NSCLC患者肿瘤组织中EGFR进行基因测序，E-cadherin、Vimentin和EGFR蛋白进行免疫组织化学法检测，分析3者在晚期NSCLC中的临床意义及内在联系。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2010年1月-2013年1月在潍坊医学院附属医院行穿刺或支气管镜活检的晚期NSCLC患者的肿瘤组织。根据2009年第七版的肺癌TNM分期标准，78例患者临床分期为Ⅳ期（包括淋巴结及远处转移）。其中，男性54例，女性24例；年龄＜60 岁30例，≥60岁48例，平均62.5岁；有吸烟史52例，无吸烟史26例；肺腺癌57例，鳞癌21例。正常肺组织标本16例作为对照组。

1.2方法

将NSCLC组织行石蜡包埋，4μm厚度切片，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.2.1DNA提取和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，RT-PCR）石蜡切片的DNA提取：①将5～10个切片10 000 r/min离心1 min，加入250ul Buffer TL收集管A，90℃孵育1h。②室温放置1min，12 000 r/min离心2 min，移液器吸取200μl组织液体至1.5ml收集管B中，加入20μl Omega Business蛋白酶（蛋白酶K 20 mg/ml），55℃水浴，过夜消化。③加入250μl Buffer BL于过夜消化的液体中，加入4μl助沉剂，70℃水浴箱内水浴10 min，期间进行DNA吸附柱平衡准备。④DNA吸附柱中纯化，洗脱液体，循环2次。将吸附柱装至新的无菌Eppendorf管中，加入70℃预热的Elution Buffer，静置＞3 min，12 000 r/min离心2 min。对提取的DNA进行质量鉴定。PCR扩增EGFR 18～21号外显子。将PCR产物送至大连宝生生物工程有限公司进行测序，并将测序结果与正常基因序列进行比对分析。1.2.2免疫组织化学（EnVision）法常规脱蜡至水，抗原修复处理，滴加一抗（EGFR、E-cadherin、Vimentin），37℃培养箱孵育45 min，滴加二抗（K5007），二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，自来水反蓝，脱水透明，中性树脂封固。阳性对照采用北京中杉生物科技有限公司提供的阳性片，阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）液代替一抗。判读方法：阳性为细胞出现棕黄色颗粒，阴性为无显色。E-cadherin、Vimentin和EGFR阳性着色在细胞膜和/或细胞浆。根据其染色程度及细胞数量进行染色评分判读，阳性细胞评分法：阴性为0分，阳性细胞比例＜25%为1分，阳性细胞比例25%～50%为2分，阳性细胞比例51%～75%为3分，阳性细胞比例＞75%为4分。细胞染色程度评分法：肿瘤细胞不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。上述两项之和即为肿瘤细胞的染色评分，总分0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～6分为阳性（++），7～12分为强阳性（+++）。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，率的比较用χ2检验，1≤T＜5时，采用校正公式；相关性分析采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异统计学意义。

2　结果

2.1EGFR、E-cadherin和Vimentin在NSCLC组织中的表达

78例NSCLC患者基因突变率为24.4% （19/78）。EGFR、E-cadherin和Vimentin阳性表达率分别为61.5%（48/78）、43.6%（34/78）和56.4% （44/78），78例患者的EMT发生率为56.4%。16例正常肺组织EGFR、E-cadherin和Vimentin为阴性。见图1～8和表1。

2.2NSCLC组织中EGFR和EMT的表达及其与临床病理因素的相关性

78例NSCLC患者中，腺癌EGFR基因突变率高于鳞癌（50% vs 0%），经假设检验，差异有统计学意义（P＜0.05），EGFR基因突变与年龄、性别及吸烟史无关（P＞0.05）。鳞癌患者EGFR阳性表达率（81%）高于腺癌患者（54.4%），经假设检验，差异有统计学意义（P＜0.05），与患者的性别、年龄及吸烟史无关（P＞0.05）。男性EMT发生率（66.7%）高于女性（33.3%），经假设检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；EMT发生率与组织类型、吸烟史及年龄无关（P＞0.05）。见表2。

图1　E-cadherin在NSCLC肿瘤细胞膜和细胞浆中表达（EnVision×200）

图2　Vimentin阴性（EnVision×200）

图3　Vimentin在NSCLC肿瘤细胞浆中表达（EnVision×200）

图4　E-cadherin阴性（EnVision×200）

图5　外显子19杂合缺失突变（DelL747-S752）正向测序图

图6　外显子19杂合缺失突变（DelL747-S752）反向测序图

图7　外显子21 858密码子杂合点突变（CTG>CGG）正向测序图

图8　外显子21 858密码子杂合点突变（CTG>CGG）反向测序图

2.3EGFR基因型与晚期NSCLC中EMT的相关性

晚期NSCLC存在EGFR基因突变的EMT发生率（21.1%）明显低于无EGFR基因突变的EMT发生率（67.8%），差异有统计学意义（P =0.000）。

表1　EGFE和EMT在晚期NSCLC及正常肺组织中的表达例

表2　临床病理因素与晚期NSCLC组织中EGFE和EMT表达的相关性例

2.4EGFR蛋白与NSCLC中EMT的相关性

Spearman秩和相关性分析显示，78例晚期NSCLC组织中44例发生EMT，其中32例EGFR阳性表达，12例EGFR阴性表达；34例未发生EMT的晚期NSCLC患者中，20例EGFR阳性表达，14例EGFR阴性表达。对EMT和EGFR的表达状态进行Spearman相关性分析，结果显示两指标有相关性（r=0.236，P =0.037）。

3　讨论

EMT是上皮细胞在与周围间质的相互作用过程中，逐渐获得某些间质细胞特有性状的现象，以E-cadherin阳性、Vimentin阴性为表征上皮型；以E-cadherin阴性、Vimentin阳性为表征间质型。Hazan等[1]报道，E-cadherin及Vimentin细胞膜或细胞浆染色与Western blot检测结果有较好的一致性，免疫组织化学法结果可以表征EMT状态。EMT的发生涉及信号转导通路和上皮表型蛋白丢失[1]，因此，本实验通过分析EMT与EGFR的相关性，初步探讨EGFR信号转导能否诱导EMT的形成。

78例NSCLC患者中EGFR基因突变率为24.4%（19/78），腺癌高于鳞癌，差异有统计学意义（P＜0.05），EGFR突变与吸烟及性别无关（P＞0.05）。国内报道，中国人EGFR突变率为19.2%～33.3%[2-4]。EGFR蛋白在许多肿瘤中过表达，在肺癌的表达率为53%～69%，其与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关[5]，在本实验中，NSCLC组织中EGFR蛋白阳性表达率为61.5%（48/68），腺癌的患者EGFR阳性表达率低于鳞癌患者（P＜0.05），与患者的性别、年龄及吸烟史无关，与Pastorino等[6]EGFR蛋白在鳞癌中过表达发生率较高的观点相同。

本研究采用免疫组织化学法检测NSCLC中E-cadherin和Vimentin的表达，阳性率分别为43.6%和56.4%。本研究发现，男性EMT发生率高于女性，差异有统计学意义（P＜0.05），国内部分文献报道，E-cadherin和Vimentin的表达与患者年龄、性别、组织类型及TNM分期无关[7-8]，但有待提高样本量进一步分析。E-cadherin和Vimentin的表达具有较好的一致性。本实验中EMT的发生率为56.4%，较田茗源等[9]的实验数据偏高，笔者分析与本研究对象为晚期NSCLC患者有关，肿瘤发生转移，说明EMT与NSCLC肿瘤细胞发生原位侵袭和远处转移密切相关。研究进一步证实来源于上皮组织的恶性肿瘤中E-cadherin降低或全部丢失，Vimentin表达升高，细胞间的粘附力降低，从而促进肿瘤组织发生EMT。

很多细胞外信号的生长因子与EMT的发生相关，如HGF、EGF、VEGF等，可以通过不同的信号传导途径诱导发生EMT[10-11]，Voon等[12]提出EMT诱导胃干细胞分化和促进肿瘤发生与EGFR信号转导通路有关。本实验结果显示，78例NSCLC组织中EGFR表达与EMT发生相关（P＜0.05）。在细胞水平上，EGFR和E-cadherin共同存在于细胞间的黏着小带，与β-catenin相连。当EGFR过表达，与细胞外的配体结合，受体自身的酪氨酸发生磷酸化，使E-cadherin从肌动蛋白丝上解离下来，细胞间的黏附力下降，促使肿瘤发生EMT。邓沁芳等[13]研究发现，EGFR突变患者的NSCLC上皮表型高于EGFR未突变患者（77.7% vs 18.2%，P＜0.05）。本研究结果与邓沁芳等[13]的相反，笔者发现，晚期NSCLC存在EGFR基因突变的EMT发生率低于无EGFR基因突变的EMT发生率（P＜0.05）。笔者分析，EGFR发生基因突变时其介导的信号通路与诱导EMT发生的能力减弱。

本实验可以得出，E-cadherin降低或全部丢失及EGFR通过信号传导通路可以促进EMT发生。同时，联合检测EGFR和EMT的表型蛋白有利于判断肿瘤的恶性程度，为临床治疗及预后提供更有效的依据。预测EMT的发生受EGFR基因突变的影响，突变型患者肿瘤不易发生EMT，而野生型患者易出现间质型转化，其作用机制有待进一步研究。

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（童颖丹编辑）

Relationship between EGFR and EMT in advanced non-small cell lung cancer

Chun-xiang Chai1, Xiao-min Wang2, Wen-jun Guo2, Yong-hong Sun2
(1. Medical Department, 2. Department of Pathology, the Affilited Hospital of
Weifang Medical University, Weifang, Shandong 261000, China)

Abstract:Objective To investigate the relationship of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Immunohistochemistry (EnVision method) was used to detect the expressions of EGFR, E-cadherin and vimentin. Exons 18-21 of EGFR were detected by PCR and gene sequencing. Results The positive expression rate of EGFR, E-cadherin and vimentin was 61.5% (48/78), 43.6% (34/78), 56.4% (44/78) respectively in the 78 cases of NSCLC; while they were not expressed in the normal group. The mutation rate of EGFR gene was 24.4%(19/78) in the NSCLC group. The incidence of EMT was higher in the EGFR wild-type group than in the mutation group (67.8% vs 21.1%). There was a positive correlation between EGFR protein expression and EMT (r= 0.236, P= 0.037). Conclusions Lost E-cadherin and EGFR signaling pathways could promote the formation of EMT.

Keywords:non-small cell lung cancer; epithelial-mesenchymal transition; epidermal growth factor receptor

[通信作者]王晓敏，E-mail：wangxiaomin1986@sina.cn

收稿日期：2014-01-07

文章编号：1005-8982（2016）03-0034-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.007

中图分类号：R734.2

文献标识码：A